Summary

Espressione genica in strati di Aleurone orzo bombardati con aumento della velocità di misura

Published: March 30, 2018
doi:

Summary

Un protocollo migliore è presentato per la misura dell’espressione genica transitoria da costruzioni del reporter in cellule di aleurone di orzo dopo il bombardamento di particelle. La combinazione di grano automatizzato rettifica con analisi dell’enzima piastra a 96 pozzetti fornisce throughput elevato per la procedura.

Abstract

Lo strato aleuronico di chicchi d’orzo è un importante sistema modello per l’espressione di gene ormone-regolato nelle piante. In cellule di aleurone, geni richiesti per la germinazione o lo sviluppo iniziale del semenzale attivati da gibberelline (GA), mentre i geni associati con le risposte di sforzo sono attivati da acido abscissico (ABA). I meccanismi di segnalazione GA e ABA possono essere interrogati dall’introduzione di costruzioni di gene del reporter in cellule di aleurone via bombardamento di particelle, con l’espressione transitoria risultante misurata mediante analisi dell’enzima. Un protocollo migliorato è segnalato che parzialmente automatizza e semplifica il passaggio di omogeneizzazione di grano e l’analisi dell’enzima, che consente una velocità effettiva significativamente maggiore rispetto ai metodi esistenti. Omogeneizzazione dei campioni grano viene effettuata utilizzando un omogeneizzatore automatizzato del tessuto, e GUS (β-glucuronidasi) le analisi sono effettuate utilizzando un sistema di piastra a 96 pozzetti. Risultati rappresentativi utilizzando il protocollo suggeriscono che l’attività della fosfolipasi D può svolgere un ruolo importante nell’attivazione dell’espressione genica di HVA1 di ABA, attraverso il fattore di trascrizione TaABF1.

Introduction

Lo strato aleuronico orzo è un sistema consolidato modello per lo studio dell’espressione di gene ormone-regolato in piante1. In particolare, un numero di geni richiesti per la germinazione o lo sviluppo iniziale del semenzale è attivato da gibberelline (GA), mentre i geni associati con le risposte di sforzo sono attivati da acido abscissico (ABA). La GA e ABA vie di segnalazione sono intrecciate, come l’espressione di alcuni geni attivati dal GA è inibita da ABA e viceversa1.

Una strategia importante per comprendere che il ruolo degli attori particolari nella segnalazione di GA/ABA è stata l’introduzione di costrutti genici effettrici tramite bombardamento di particelle, seguita dall’espressione transitoria di costruzioni del reporter che consentono l’effetto risultante sul espressione genica a valle deve essere determinato. L’uso di geni reporter come GUS (β-glucuronidasi) o Luciferase permette la misura sensibile e quantitativa dell’espressione genica in particolare all’interno delle cellule che hanno ricevuto il costrutto dell’effettore. Ad esempio, l’introduzione di un costrutto di effettori che codifica per il fattore di trascrizione TaABF15,6 stabilito che geni indotti da ABA come HVA1 sono indotte da TaABF1, mentre GA-indotta di geni come Amy32b sono repressi. Bombardamento di particelle come una strategia sperimentale è stato utilizzato da più laboratori di approfondire diversi aspetti della GA/ABA segnalazione. Tale lavoro ha portato all’identificazione di elementi promotore importanti per l’attivazione indotta da GA2 sia geni indotti da ABA3e alla scoperta della proteina chinasi4 e fattori di trascrizione5 che regolano la espressione di questi geni.

Gli esistenti protocolli2,3,4,5,6 per bombardamento di particelle e successiva misura della espressione genica transitoria sono abbastanza laborioso, come ogni set di bombardato a malapena grani è omogeneizzato a mano in un mortaio e pestello e l’analisi dell’enzima sono effettuate individualmente. Questo manoscritto segnala un protocollo migliorato che parzialmente automatizza e semplifica il passaggio di omogeneizzazione e GUS saggi per consentire una velocità effettiva significativamente maggiore, permettendo un maggior numero di trattamenti da sottoporre all’esperimento stesso, e/o la inclusione di ulteriori repliche per ogni trattamento ottenere altri risultati statisticamente robusti. Risultati rappresentativi sono indicati per l’espressione di HVA1 e Amy32b costruzioni del reporter, regolata dal fattore di trascrizione TaABF1 nonché da GA, ABA e altre molecole regolatrici.

Protocol

1. preparazione del Effector e Gene Reporter costruisce Costruire costrutti effettrici che impiegano un promotore costitutivo (es. mais ubiquitina, UBI) all’espressione di unità da un telaio di lettura aperto desiderato. Ad esempio, costruire un plasmide contenente UBI::TaABF1 di forte espressione costitutiva unità di TaABF15. Costruire costruzioni del reporter che includono il promotore cui attività deve essere misurato, posto a Monte di un open reading fr…

Representative Results

La tecnica qui descritta può essere utilizzata per introdurre qualsiasi costruzione di prova gene nelle cellule di aleurone di chicchi d’orzo. Il livello di espressione dal gene test quindi può essere convenientemente misurato (Figura 2). Il protocollo di throughput superiore descritto qui notevolmente aumenta l’efficienza del seme macinazione e la procedura di analisi enzima. Questo metodo è stato utilizzato per valutare la capacità del fattore di trascr…

Discussion

L’introduzione del gene dell’effettore costrutti tramite bombardamento di particelle, seguita dall’espressione transitoria di costruzioni del reporter è una strategia importante per il ruolo degli attori particolari nella segnalazione di GA/ABA e nel gene ormone-regolata risultante di dissezione espressione.
Tuttavia, i protocolli esistenti per lo svolgimento di tali esperimenti in orzo aleuronico cellule2,3,4,<su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano Greyson Butler e Margaret Barrett per aiuto nello svolgere gli esperimenti, Judy Stone per consigli su omogeneizzazione di grano e Lynn Hannum per consigli su fluorometria. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation (IOB 0443676), di un premio per lo sviluppo istituzionale (IDeA) dal National Institute of General Medical Sciences, della National Institutes of Health, sotto concessione numero P20GM0103423 e da sovvenzioni da la divisione di Colby College di scienze naturali.

Materials

GeneElute HP plasmid Maxiprep kit Sigma NA0310-1KT
UV-vis spectrophotometer Nanodrop ND-1000
Himalaya barley grains / / A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C)
sodium succinate Sigma S2378 Reagent for Imbibing Solution
calcium chloride (dihydrate) Fisher C79-500 Reagent for Imbibing Solution
Imbibing Solution home made / 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use.
chloramphenicol Sigma C0378 Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol.
vermiculite Fisher NC0430369 Used for vermiculite plates.
filter paper circles (90 mm) Whatman 1001 090 Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation
Vermiculite Plates home made / Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave.
forceps (fine pointed) Fisher 13-812-42 Used for removing seed coat from barley grains.
forceps (ultra fine point) Fisher 12-000-122 Used for removing seed coat from barley grains.
gold microcarriers (1.6 μm) BioRad 1652264
macrocarriers BioRad 1652335
calcium chloride (dihydrate) Fisher C79-500 Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
spermidine Sigma S0266 Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months).
rupture discs (1550 psi) BioRad 1652331
stopping screens BioRad 1652336
macrocarrier holders BioRad 1652322
Biolistic particle delivery system BioRad PDS-1000/He
sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma S9638 Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
sodium phosphate dibasic Sigma S9763 Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
1M sodium phosphate pH 7.2 home made / Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2.
dithiothrietol (DTT) Sigma 43819 Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots.
leupeptin Sigma L2884 Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C.
glycerol Sigma G5516 Prepare a 50% solution in water.
Grinding Buffer home made / Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL.
stainlesss steel beads (5 mm) Qiagen 69989
2.0 mL tubes Eppendorf 22363352 This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer.
bead homogenizer (TissueLyser) Qiagen 85210
12mm x 75 mm glass test tubes Fisher
luciferin Goldbio LUCK-100 Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
ATP Sigma A7699 Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C.
Tris base Sigma T1503 Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
sulfuric acid Sigma 258105 Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
1M Tris sulfate pH 7.7 home made / Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid.
magnesium chloride Sigma M9397 Dissolve in water to 2 M.
Luciferase Assay Buffer (LAB) home made / Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL.
Luciferase Assay Mixture home made / Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays.
luminometer (Sirius) Berthold /
4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) Goldbio MUG1 Dissolve in DMSO to 100 mM.
sodium azide Sigma S8032 Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C.
96 well plates (standard) Fisher 12565501
GUS assay buffer home made / Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL.
TempPlate sealing film USA Scientific 2921-1000
96 well plates (black) Costar 3916
sodium carbonate Sigma S7795 Prepare a 200 mM solution in water.
4-methylumbelliferone Sigma M1381 Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C.
microplate fluouresence reader Bio-Tek FLX-800

References

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Cite This Article
Uwase, G., Enrico, T. P., Chelimo, D. S., Keyser, B. R., Johnson, R. R. Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput. J. Vis. Exp. (133), e56728, doi:10.3791/56728 (2018).

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