Измеряя экспрессии генов в бомбардировке ячменя Aleurone слои с повышенной пропускной способностью
Summary
Улучшенная протокол представлен для измерения экспрессии генов переходных от репортера конструкции в клетках aleurone ячменя после бомбардировки частиц. Сочетание автоматизированных зерна, шлифовальные с 96-луночных пластины фермента анализов обеспечивает высокую пропускную способность для процедуры.
Abstract
Aleurone слой зерна ячменя является важной моделью системы для выражения гена гормона регулируется в растениях. В aleurone клетках гены, необходимые для прорастания или раннего развития сеянцев активируются гиббереллин (GA), в то время как гены, связанные с стрессом ответы активируются абсцизовой кислоты (ABA). Механизмы GA и ABA сигнализации могут быть допрошены путем введения Репортер ген конструкции в aleurone клетки через бомбардировка частиц, с результатом переходных измеряется с помощью фермента анализов. Улучшенная протокол сообщается, что частично автоматизирует и оптимизирует шаг гомогенизации зерна и assays энзима, позволяя значительно более высокую пропускную способность, чем существующие методы. Гомогенизация пробы зерна осуществляется с использованием автоматизированных ткани гомогенизатор, и GUS (β-глюкуронидазы) анализов осуществляется с помощью системы 96-луночных пластины. Представитель результаты, с использованием протокола показывают, что активность фосфолипазы D могут играть важную роль в активации HVA1 экспрессии генов, ABA, через фактор транскрипции TaABF1.
Introduction
Слой aleurone ячмень является система устоявшихся моделей для изучения выражения гена гормона регулируется в растения1. В частности ряд генов, необходимых для прорастания или раннего развития сеянцев активируются гиббереллин (GA), в то время как гены, связанные с стрессом ответы активируются абсцизовой кислоты (ABA). ГА и ABA, сигнальные пути взаимосвязаны, как выражение некоторых генов, GA-активированный тормозится Аба и наоборот1.
Ценный стратегия для понимания, что роль конкретного участников в GA/Аба сигнализации был введение эффекторных гена конструкции через бомбардировка частиц, следуют переходных выражение репортер конструкций, которые позволяют результирующий эффект на вниз по течению ген выражение определяется. Использование репортер генов как гусь (β-глюкуронидазы) или Люцифераза позволяет чувствительной и количественного измерения экспрессии генов специально внутри клетки, которые получили эффекторных конструкции. Например введение конструкцией эффекторных кодирования фактор транскрипции TaABF15,6 установлено, что Аба индуцированной генов, например HVA1 индуцированных TaABF1, а GA-индуцированной генов, например Amy32b подвергаются репрессиям. Бомбардировка частиц как экспериментальная стратегия использовала несколько лабораториями для изучения различных аспектов GA/Аба сигнализации. Такая работа привела к выявлению промоутер элементов, важных для активации GA-индуцированной2 и ABA-индуцированной генов3и к открытию киназы протеина4 и транскрипции факторы5 , которые регулируют экспрессии этих генов.
В существующие протоколы2,3,4,5,6 бомбардировка частиц и последующее измерение переходных гена выражения являются довольно трудоемким, как каждый набор бомбардировке едва зерна гомогенизированные вручную в ступку и пестик и фермента анализов осуществляется индивидуально. Эта рукопись сообщает улучшение протокол, который частично автоматизирует и оптимизирует этапа гомогенизации и GUS assays позволяют значительно более высокую пропускную способность, позволяя большее количество процедур для проверки в том же эксперимент, и/или включение более репликация для каждого лечения получить более статистически надежные результаты. Представитель результаты представлены для выражения HVA1 и Amy32b конструкций репортер, регулируется фактор транскрипции TaABF1, а также GA, Аба и других регуляторных молекул.
Protocol
Representative Results
Discussion
Введение гена эффекторных конструкции через бомбардировка частиц, следуют переходных выражение репортер конструкций является ценным стратегия для рассечения роль конкретных участников в GA/Аба сигнализации и в результате гена гормона регулируется выражение.
Однако существующие пр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят за помощь в проведении экспериментов, Джуди камень для консультации по зерна гомогенизации и Линн Ханнум для консультации по флюометрия Грейсон Батлер и Маргарет Барретт. Эта работа была поддержана Национальный научный фонд (IOB 0443676), путем институционального развития Award (IDeA) от национального института Генеральной медицинских наук национальных институтов здоровья под номер гранта P20GM0103423 и гранты Отдел Colby Колледж естественных наук.
Materials
| GeneElute HP plasmid Maxiprep kit | Sigma | NA0310-1KT | |
| UV-vis spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Himalaya barley grains | / | / | A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C) |
| sodium succinate | Sigma | S2378 | Reagent for Imbibing Solution |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Reagent for Imbibing Solution |
| Imbibing Solution | home made | / | 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use. |
| chloramphenicol | Sigma | C0378 | Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol. |
| vermiculite | Fisher | NC0430369 | Used for vermiculite plates. |
| filter paper circles (90 mm) | Whatman | 1001 090 | Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation |
| Vermiculite Plates | home made | / | Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave. |
| forceps (fine pointed) | Fisher | 13-812-42 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| forceps (ultra fine point) | Fisher | 12-000-122 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| gold microcarriers (1.6 μm) | BioRad | 1652264 | |
| macrocarriers | BioRad | 1652335 | |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| spermidine | Sigma | S0266 | Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months). |
| rupture discs (1550 psi) | BioRad | 1652331 | |
| stopping screens | BioRad | 1652336 | |
| macrocarrier holders | BioRad | 1652322 | |
| Biolistic particle delivery system | BioRad | PDS-1000/He | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| sodium phosphate dibasic | Sigma | S9763 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| 1M sodium phosphate pH 7.2 | home made | / | Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2. |
| dithiothrietol (DTT) | Sigma | 43819 | Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots. |
| leupeptin | Sigma | L2884 | Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C. |
| glycerol | Sigma | G5516 | Prepare a 50% solution in water. |
| Grinding Buffer | home made | / | Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL. |
| stainlesss steel beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 2.0 mL tubes | Eppendorf | 22363352 | This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer. |
| bead homogenizer (TissueLyser) | Qiagen | 85210 | |
| 12mm x 75 mm glass test tubes | Fisher | ||
| luciferin | Goldbio | LUCK-100 | Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| ATP | Sigma | A7699 | Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C. |
| Tris base | Sigma | T1503 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| sulfuric acid | Sigma | 258105 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| 1M Tris sulfate pH 7.7 | home made | / | Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid. |
| magnesium chloride | Sigma | M9397 | Dissolve in water to 2 M. |
| Luciferase Assay Buffer (LAB) | home made | / | Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL. |
| Luciferase Assay Mixture | home made | / | Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays. |
| luminometer (Sirius) | Berthold | / | |
| 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) | Goldbio | MUG1 | Dissolve in DMSO to 100 mM. |
| sodium azide | Sigma | S8032 | Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| 96 well plates (standard) | Fisher | 12565501 | |
| GUS assay buffer | home made | / | Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL. |
| TempPlate sealing film | USA Scientific | 2921-1000 | |
| 96 well plates (black) | Costar | 3916 | |
| sodium carbonate | Sigma | S7795 | Prepare a 200 mM solution in water. |
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C. |
| microplate fluouresence reader | Bio-Tek | FLX-800 |
References
- Chen, K., An, Y. Q. C. Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone. J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).
- Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters. Plant Cell. 4, 203-211 (1992).
- Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. D. Modular nature of abscisic acid (ABA) response complexes; composite promoter units that are necessary and sufficient for ABA induction of gene expression. Plant Cell. 8, 1107-1119 (1996).
- Gómez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., Ho, T. H. D. Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules. Plant Cell. 13, 667-679 (2001).
- Johnson, R. R., Shin, M., Shen, J. Q. The wheat PKABA1-interacting factor TaABF1 mediates both abscisic acid-suppressed and abscisic acid-induced gene expression in bombarded aleurone cells. Plant Mol. Biol. 68, 93-103 (2008).
- Harris, L. J., Martinez, S. A., Keyser, B. R., Dyer, W. E., Johnson, R. R. Functional analysis of TaABF1 during abscisic acid and gibberellin signaling in aleurone cells of cereal grains. Seed Science Res. 23, 89-98 (2013).
- Shen, Q., Casaretto, J., Zhang, P., Ho, T. H. D. Functional definition of ABA-response complexes: the promoter units necessary and sufficient for ABA induction of gene expression in barley (Hordeum vulgare). Plant Mol. Biol. 54, 111-124 (2004).
- Ritchie, S., Gilroy, S. Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 2697-2702 (1998).
- Takemiya, A., Shimazaki, K. Phosphatidic acid inhibits blue light-induced stomatal opening via inhibition of protein phosphatase 1. Plant Physiol. 153, 1555-1562 (2010).
- Zou, X., Seeman, J. R., Neuman, D., Shen, Q. J. A WRKY gene from creosote bush encodes an activator of the abscisic acid signaling pathway. J. Biol. Chem. 279, 55770-55779 (2004).
- Ishibashi, Y., et al. Reactive oxygen species are involved in gibberellin/abscisic acid signaling in barley aleurone cells. Plant Physiol. 158, 1705-1714 (2012).
- Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
- Hong, J. Y., et al. Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor. Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).
- Lopez-Molina, L., Mongrand, S., McLachlin, D. T., Chait, B. T., Chua, N. H. ABI5 acts downstream of ABI3 to execute an ABA-dependent growth arrest during germination. Plant J. 32, 317-328 (2002).
- Zhou, X., et al. SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5. Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).
- Zong, W., et al. Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes. Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).
