Contrôle spatial et temporel de l’Activation des cellules T à l’aide d’un agoniste Photoactivatable
Summary
Ce protocole décrit une méthode basée sur l’imagerie pour activer les lymphocytes T à l’aide de photoactivatable peptide-MHC, permettant un contrôle précis spatio-temporelle de l’activation des cellules T.
Abstract
Lymphocytes T engagent rapide, polarisée de signalisation, survenant dans les minutes suivant l’activation de TCR. Cela induit la formation de la synapse immunologique, une jonction cellule-cellule stéréotypés qui régule l’activation des cellules T et les cibles directionnellement réponses effectrices. Pour étudier efficacement ces processus, il faut une approche d’imagerie adaptée afin de pouvoir saisir les réponses rapides, polarisées. Ce protocole décrit un tel système, qui repose sur une photoactivatable peptide-major complexe d’histocompatibilité (SPHL) qui est non-stimulateur jusqu’à ce qu’elle est exposée aux rayons ultraviolets. Decaging ciblée de ce réactif au cours d’expériences de vidéomicroscopie permet un contrôle précis spatio-temporelle de l’activation de TCR et surveillance haute résolution des réponses cellulaires ultérieures par réflexion totale interne (FRBR) d’imagerie. Cette approche est également compatible avec les stratégies de perturbations génétiques et pharmacologiques. Cela permet l’assemblage des voies moléculaires bien définis qui relient le TCR de signalisation à la formation des structures du cytosquelette polarisées qui sous-tendent la synapse immunologique.
Introduction
Les lymphocytes T (cellules T) jouent un rôle central dans l’immunité cellulaire en reconnaissant les peptides antigéniques affichées dans le contexte de la surface de la cellule MHC. Reconnaissance de l’antigène, qui est véhiculée par le TCR, entraîne la différenciation des cellules naïves T et fait la promotion de la fourniture de réponses cytolytiques et communicatifs par les populations de l’effecteur. Engagement de TCR induit également des changements dramatiques dans l’architecture cellulaire. En quelques minutes, les cellules T gloms sur le côté de la cellules présentatrices d’antigène (APC), formant une interface polarisée appelée la synapse immunologique (IS)1,2. L’IS potentialise les réponses effectrices des lymphocytes T en permettant la sortie directionnelle des cytokines ou, dans le cas de lymphocytes T cytotoxiques (CTL), des protéines lytiques qui détruisent l’APC.
Engagement de TCR par SPHL induit la phosphorylation rapide de plusieurs molécules d’adaptateur en aval, y compris l’éditeur de liens pour l’Activation des cellules T (LAT), qui favorise en fin de compte robuste remodelage du cytosquelette synaptique2. Filaments d’actine cortical (actine-F) pousse les lymphocytes T s’étendant sur la surface de l’APC et puis il résout en une structure annulaire caractérisée par l’accumulation de F-actine à la périphérie de l’IS et l’appauvrissement de la couche du centre. Formation d’actine F anneau est étroitement couplée à une réorientation du centre organisateur de microtubules (MTOC, également appelée centrosome dans les lymphocytes T) à un poste juste en dessous du centre de l’interface. Les deux événements se produisent dans les minutes suivant la reconnaissance de l’antigène initial et établissent le contexte architectural dans lequel les événements d’activation ultérieure et effectrices réponses se produisent.
Pour étudier la formation IS, différents laboratoires ont mis au point des approches dont l’APC est remplacé par une surface de verre qui contient immobilisée TCR ligands ou prend en charge une bicouche lipidique que lui-même contienne les ligands3,4. Les lymphocytes T forment IS-comme contacts sur ces surfaces qui peuvent être photographiées par microscope à fluorescence réflexion totale interne (FRBR) ou microscopie confocale, permettant des études à haute résolution d’activation des cellules T et formation IS.
Bien que ces approches ont permis pour l’excellente visualisation de l’IS entièrement assemblé, une grande partie de la signalisation de la ligature TCR:pMHC suivante se produit quelques secondes, ce qui complique les efforts pour déterminer la séquence des événements après l’activation de la TCR avec précision . Pour contourner ce problème, une approche de photoactivation a élaboré, dans lequel photoactivatable SPHL est utilisé pour obtenir un contrôle spatio-temporelle du TCR activation5,6,7. Dans ce système, les cellules T sont attachés aux surfaces de verre contenant la SPHL photoactivatable qui est non-stimulateur pour le TCR jusqu’à irradié par la lumière ultraviolette (UV). L’irradiation UV d’une région de microns de taille de la surface sous la cellule T supprime la photocage création d’une zone de stimulation qui peut être reconnue par les lymphocytes T. Les événements ultérieurs de signalisation et le remodelage du cytosquelette sont contrôlés puis à l’aide de reporters fluorescents génétiquement encodés. Deux versions de photoactivatable de peptides antigéniques, lépidoptère du cytochrome c88-103 (MCC) et l’ovalbumine257-264 (OVA), qui sont présentés dans le contexte de la classe II de MHC I-Ek et de la classe I de MHC H2-Kb, respectivement, ont été développés (Figure 1). Cela permet l’analyse des deux CD4+ T des cellules spécifiques pour MCC-je-Ek (exprimant la 5C. C7, 2 b 4, ou AND TCRs) et CD8+ T des cellules spécifiques d’ovules-H2-Kb (exprimant le TCR OT1).
Ces dix dernières années, l’approche de photoactivation et imagerie de TCR a été utilisé pour établir la cinétique précise TCR premières étapes de la signalisation et aussi d’identifier les voies moléculaires qui régissent le remodelage du cytosquelette polarisée5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. par exemple, le test a joué un rôle important dans la détermination de cette centrosome réorientation vers l’APC est médiée par un gradient localisé de lipides deuxième messager diacylglycérol centré à l’IS. Il est prévu que cette méthodologie continueront d’être précieux pour des applications exigeant une analyse d’imagerie à haute résolution de la fonction des cellules T.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ces dernières années, la lumière a émergé comme un excellent outil pour activation spatio-temporelle contrôlée des processus cellulaires. Diverses méthodes ont été développées, chacune avec les inconvénients et les avantages associés. Le système décrit ici, qui repose sur la decaging des ligands immobilisés, extracellulaires, est parfaitement adapté pour l’analyse des réponses de signalisation rapides, subcellulaires, polarisées. Cette approche a été appliquée afin d’examiner la formation IS da…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres du laboratoire Huse de conseils et d’assistance. Soutenu par les US National Institutes of Health (R01-AI087644 à M.H.) et P30-CA008748 au Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.
Materials
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermofischer Scientific | 155361 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| EZ-Link NHS-Biotin | Thermofischer Scientific | 20217 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| Streptavidin | Thermofischer Scientific | 434301 | |
| BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | Will be used to biotinylate proteins |
| Biotinylated Hb I-EK | For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Biotinylated NPE-MCC I-EK | Anaspec | Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated αH2-Kk antibody | BD Biosciences | 553591 | |
| Biotinylated NPE-OVA H2-Kb | Anaspec | Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated KAVY H2-Db | Anaspec | Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated ICAM1 | For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Hand held UV lamp | UVP | UVGL-25 | Lamp is held < 1 cm from the sample. 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging. |
| Olympus IX-81 OMAC TIRF system. | Olympus | Additional information about the imaging system can be found in Figure 6 | |
| Mosaic digital diaphragm | Andor | ||
| Slidebook software | Intelligent Imaging Innovations |
References
- Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the structure and function of the immunological synapse. Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).
- Liu, X., Huse, M. Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction. Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).
- Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
- Dustin, M. Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers. Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).
- Chauveau, A., Le Floc’h, A., Bantilan, N. S., Koretzky, G. a., Huse, M. Diacylglycerol kinase α establishes T cell polarity by shaping diacylglycerol accumulation at the immunological synapse. Sci. Signal. 7, ra82 (2014).
- Huse, M., et al. Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist. Immunity. 27, 76-88 (2007).
- Quann, E. J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells. Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).
- Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse. PLoS One. 9, 1-8 (2014).
- Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. K., Huse, M. Diacylglycerol promotes centrosome polarization in T cells via reciprocal localization of dynein and myosin II. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 11976-11981 (2013).
- Quann, E. J., Liu, X., Altan-Bonnet, G., Huse, M. A cascade of protein kinase C isozymes promotes cytoskeletal polarization in T cells. Nat. Immunol. 12, 647-654 (2011).
- Boniface, J. J., Reich, Z., Lyons, D. S., Davis, M. M. Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).
- Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).
- Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).
- Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells. J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).
- Nguyen Duc, T., Huse, M. A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors. ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).
- Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. Temporally precise in vivo control of intracellular signalling. Nature. 458, 1025-1029 (2009).
- Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
- Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).
- Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
- Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors. Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).
- Grusch, M., et al. Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light. EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).
- Yi, J., et al. Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage. J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).
