貪食能アッセイのアストロ サイトを介した新規体外ライブ イメージングを使用して pH インジケーター共役シナプトソーム
Summary
このプロトコルは、アストロ サイトの貪食能を測定するライブ イメージングの in vitro貪食アッセイを提示します。精製したラット アストロ サイトやミクログリアは、pH インジケーター共役シナプトソームと共に使用されます。このメソッドは、リアルタイムの貪食・分解速度を検出することができ、アストロ サイト細胞貪食の変調の要因を識別するために適切なスクリーニングのプラットフォームを提供します。
Abstract
アストロ サイトは脳の主要な細胞型であり、シナプスや血管に直接お問い合わせください。アストロ サイトはまた発達シナプスの除去とのクリアランスなど、様々 な貪食プロセスに参加を最近の研究で示されているミクログリア細胞は、主要な免疫細胞と脳の食のみと考えられてきたがアルツハイマー病 (AD) におけるアミロイド β 斑。これらの調査結果にもかかわらずアストロ貪食の効率とそのターゲットの劣化は不明ミクログリアのそれと比較します。情報の欠如は、たいがいは、アストロ サイト、ミクログリアによる貪食能の動態が簡単に匹敵するアッセイ システムの欠如です。この目標を達成するためには、精製されたアストロ サイトやミクログリアの貪食能を評価する長期的なライブ イメージングの in vitro貪食能試の金を開発しました。このアッセイで貪食・分解のリアルタイム検出は、リソソームなどの酸性オルガネラの明るい赤の蛍光を発する pH インジケーター共役シナプトソームを使用して可能です。当社の新規アッセイは、ライブ イメージングによる貪食のシンプルで効果的な検出を提供します。さらに、このin vitro貪食アッセイは、化学物質とを強化したり、アストロ サイトの貪食能を阻害する化合物を識別するためにスクリーニングのプラットフォームとして使用できます。シナプスの刈り込みの異常と病原性蛋白質の蓄積は、精神疾患や神経変性疾患の原因と示されている、化学薬品およびグリア細胞の貪食能を調節する化合物を様々 な治療に役立つはず神経疾患。
Introduction
脳の非興奮性細胞を参照、グリア細胞は、中枢神経系 (CNS) における主要な細胞タイプです。以前は、グリア細胞は、主に神経細胞の生存と基底のシナプス特性を維持するために受動の役割を果たす単なる支持細胞として見なされていた。ただし、出現の証拠は明らかにしたグリア細胞がシナプス形成1,2,3とシナプスを媒介する脳のホメオスタシス維持などの神経生物学のさまざまな側面でより積極的な役割を果たしています。除去4、5、および変調シナプス可塑性6,7。中枢神経系のグリア細胞には、オリゴデンドロ サイト、ミクログリア、アストロ サイトが含まれます。これらの細胞、アストロ サイト、ミクログリアの中でシナプス4,5、アポトーシス細胞8、ニューラル破片9、およびアミロイド β などの病原性タンパク質を巻き込むによる貪食の役割を果たすことが示されています。斑10,11。脳の発達、アストロ サイトから MERTK と神経: MEGF10 依存貪食4背側外側膝状核 (dLGN) でシナプスを排除します。同様に、ミクログリアはまた古典的な補体カスケード5を通じて発達段階のシナプスの C1q コーティングを除去します。興味深いことに、シナプス刈り込みの欠陥がいくつかの神経疾患の創始者の 1 つをすることができますが示唆されています。たとえば、(C4) に補体成分 4 の変異ミクログリアによって補体を介したシナプス刈り込みを生じ、強く人間12で統合失調症の有病率に関連付けられて示されています。最近の論文では、古典的補体経路 hyperactivated は、広告の開始段階とこの疾患13初期シナプス損失を誘発することも示しています。
ミクログリアを介した貪食と比べると、アストロ サイトを介した貪食が開始し、さまざまな神経疾患の進行に寄与するかどうかは不明瞭です。しかし、最近の論文は示唆やアストロ サイトによる通常のシナプス刈り込みの率を変える要素脳のホメオスタシスを混乱させる可能性があります広告感受性と病理14に貢献。アストロ サイトによるシナプス刈り込みの力強く、アポの異性、広告 (ApoE2) の保護の対立遺伝子と強く強化率と率を大幅に削減 (ApoE4) の広告の危険の対立遺伝子によって制御されます。また、 ApoE4を発現するトランスジェニック マウスの制御やApoE2マウス14よりもはるかに多くのシナプス C1q 蓄積。これらのデータは、初期のアストロ サイトを介した貪食能を障害する示唆している AD 脳活性化補体を介したミクログリア細胞貪食、シナプス変性を運転する老齢 C1q コーティング シナプス/シナプスの残骸の蓄積を引き起こす可能性があります.ApoE4キャリアにおけるアストロ サイトの障害の貪食能も広告の影響を受けた脳アミロイド ・ ベータ斑の制御不能な蓄積に貢献するかもしれない。
さらに、高齢者のショウジョウバエ脳のグリア細胞がドレイパー、アストロ サイトがシナプスを phagocytosing 用神経: Megf10の相同物の減らされた翻訳による貪食能力を失うことが示されています。ドレイパー レベルを復元救出効率的に瓦礫損傷した軸索が老化誘導を示す若い脳と同程度に高齢者の脳のグリア細胞の貪食能の貪食能の変化アストロ サイト脳のホメオスタシスの15の破壊に貢献するかもしれない。
これらの新しい調査結果に基づいて、予防し、様々 な脳神経疾患を治療する魅力的な治療戦略になる可能性がありますアストロ サイトの貪食能を調節すること。この点で、リソソーム酸性ナノ16の酸性化を誘導し、トランスクリプション要因 EB (TFEB) は、強化することができますを過剰発現によるアストロ サイトなどの貪食能を強化するいくつかの試みがずっとあります。リソソーム器官17。これらの試みにもかかわらずまだわかりにくい各アストロ サイトやミクログリア細胞の貪食反応速度論で異なると増加か各種疾患における貪食能力を減少する必要がありますか。
アストロ サイトの貪食能をリアルタイムで検出するための新規の in vitroアッセイを提案します。データは、アストロ サイト、ミクログリアの貪食・分解の別の速度を表示します。アストロ エアコン媒体 (ACM)、アストロ サイトから分泌因子が含まれ、アストロ サイト、ミクログリアの効果的な貪食能に不可欠です。さらに、神経: Megf10、アストロ サイト、 Ced 1とドレイパーの相同物の貪食受容体貪食のアストロ サイトを介した8,18で重要な役割を果たしています。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、長期ライブ イメージングの in vitro貪食能試金精製のグリア細胞と pH インジケーター共役シナプトソームを使用しての手法を提示します。ミクログリアと比較して示すアストロ サイト シナプトソーム貪食刺激による別の貪食・分解能力を持っています。さらに、我々 のデータは、架橋分子 GAS6、蛋白質、MEGE8 などが含まれて、アストロ サイト分泌の要因が効率的な PS ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者ありがとう淵チュ チョン彼女の実験的なサポート synaptosome 精製と Jungjoo 公園の中に PS 露出シナプトソームのイメージの。さらに、役に立つ議論のため鄭研究室のすべてのメンバーに感謝いたします。この作品は、韓国 (NRF) 交付金 (MSIP) (NRF 2016M3C7A1905391 と NRF 2016R1C1B3006969) の韓国の政府によって資金を供給の国立研究財団によって支えられた (W. S.C)。
Materials
| Synaptosome purification | |||
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 | BIO-RAD | 5000202 | |
| pH indicator conjugation | |||
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | LPS solution | DMSO100 | |
| pHrodo red, succinimidyl ester | Molecula probes | P36600 | |
| Immunopanning | |||
| 10X Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Sigma | E7510 | |
| Bovine serum albumin | Bovogen | BSA025 | |
| Deoxyrebonuclease 1 (DNase) | Worthington | Is002007 | |
| (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| (dPBS) | Welgene | LB001-02 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1) | Vector Labs | L-1100 | |
| Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-044 | |
| Goat anti-mouse IgM (μ-chain) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | |
| Heparin-binding epidermal growth factor | Sigma | E4643 | |
| Human HepaCAM antibody | R&D systems | MAB4108 | |
| Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52) | eBioscience | 14-0497-82 | |
| L-cysteine | Sigma | C7880 | |
| L-glutamate | Gibco | 25030-081 | |
| N-acetly-L-cyteine (NAC) | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| O4 hybridoma supernatant(mouse IgM) | Bansal et al.23 | ||
| Papain | Worthington | Is003126 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluristrainer 20 μm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Purified rat anti-mouse CD45 | BD Pharmingen | 550539 | |
| Purified mouse anti-rat CD45 | BD Pharmingen | 554875 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Trypsin | Sigma | T9935 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |
| Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Collect IP-ACM | |||
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k) | PALL | MAP010C37 | |
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k) | PALL | MAP030C37 | |
| Phagocytosis live imaging assay | |||
| Juli stage | NanoEntek | ||
| Time Series Analyzer V3 plugins | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html |
References
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