Un In Vivo Duo-color méthode d’imagerie vasculaire dynamique après contusion médullaire

Toutes les procédures de traitement chirurgical et animaux ont été effectuées tel qu’approuvé en vertu du Guide pour les soins et Use of Laboratory Animals (National Research Council) et les lignes directrices de l’Indiana University School of Medicine institutionnels Animal Care et l’utilisation Comité. 1. préparation chirurgicale Stériliser tous les instruments chirurgicaux, y compris le stabilisateur de la colonne vertébrale. Nettoyez la table d’opération chirurgicale et tous les alentours d’éthanol à 70 %. Pour la préparation de cette intervention chirurgicale sans survie, placez un coussin propre chirurgical sur le dessus un 37 ° C coussin chauffant. Utilisez six semaine vieux rat Sprague Dawley (SD) pour cette étude. Peser et anesthésier le rat avec une injection intrapéritonéale de kétamine (87,7 mg/kg) et mélange de xylazine (12,3 mg/kg). Confirmer la bonne étape de l’anesthésie lorsque l’animal cesse de répondre à un stimulus de pincée d’orteil. Injecter par voie sous-cutanée de 0,01 à 0,05 mg/kg de buprénorphine et de 5mg/kg carprofène avant la chirurgie. Raser le rat dans 2 régions : la région de la colonne cervicale sur le dos et la région du cou du côté maternel. Tamponner les zones de peau avec betadine scrub chirurgicale et lingettes d’alcool 70 %. Pommade oculaire pour prévenir la sécheresse oculaire pendant la chirurgie. Placer l’animal dans une position couchée sur le tampon propre chirurgical. 2. cathétérisme de la veine jugulaire externe Repérer la veine jugulaire externe en trouvant le point d’impulsion près de la clavicule et couper avec une paire de ciseaux de petit ressort à pratiquer une incision verticale sur le spot, qui est le point de croix de 3 points anatomiques : rame caudale de la mandibule droite, grand tubercule de l’humérus et le manubrium (Figure 1 a). Isoler le navire à l’aide de ciseaux de printemps et des pinces fines. Nouer l’extrémité distale avec 1 stériles pour sutures chirurgicales ligne (Figure 1)20. Préparez une seringue de 1 mL remplie de solution saline et relié à un cathéter spécialisé issu d’une aiguille de calibre 21 (Figure 1 b). Faire une petite incision à l’aide d’une paire de ciseaux micro sur le navire et faire glisser le cathéter dans le vaisseau. Fixer l’aiguille en nouant les deux extrémités proximales et distales (Figure 1). Le cathéter spécialisé est issu d’une aiguille de calibre 21. Broyer la pointe plate et souder avec un morceau de 2 mm de la pointe coupée d’une autre aiguille de calibre 21. Cela peut empêcher le cathéter ne glisse à l’extérieur. Remarque : Une petite quantité de sang qui coule dans l’aiguille indique que l’aiguille est entré avec succès dans un vaisseau sanguin. 3. colonne vertébrale stabilisation et laminectomie C5-C7 Placer l’animal dans une position couchée. Couper la peau le long de la ligne médiane avec une lame de bistouri n ° 15 au niveau de la colonne vertébrale désiré. Disséquer les couches musculaires de la 5ème au 7ème vertèbre cervicale (C5-C7) sur le plan bilatéral pour exposer les faces latérales (Figure 2 a)21. Remarque : Localiser la deuxième vertèbre thoracique (T2) en trouvant la pointe entre les omoplates. Compter vers le haut de la vertèbre T2 pour trouver le C7 vertèbre21,22,23,24. Stabiliser la colonne vertébrale du rat en utilisant un appareil stabilisateur modifié. Faire une fente sur les deux côtés de l’OS vertébral latéral. Faites glisser les bras en acier inoxydable sous les facettes exposés apophyse transverse et serrer les vis pour fixer la stabilité (Figure 2 b). Retirer délicatement les lamelles de C5-C7 (laminectomie, Figure 2). Placer un petit morceau de gélatine imbibé d’une solution saline sur le dessus de la dure-mère exposée pour le garder bien hydratée (Figure 2D). 4. installation de fenêtre d’imagerie biphotonique (2p) Trucs petits morceaux de gélatine dans l’écart entre les muscles et les os vertébrales, également farcir une fine ligne de gelfoam entre la moelle épinière et les os vertébrales, puis d’utiliser la colle tissu pour sceller les environs de muscle d’os. Attendre 5 min pour la dessiccation complète (Figure 2E). Remarque : Cette étape empêche les saignements futurs dans la fenêtre et la perméabilité des solutions d’immersion. Préparer 4 % d’agar avec FD2O dans un four à micro-ondes. Une fois l’agar est complètement dissoute, attendez jusqu’à ce qu’elle renvoie à une température palpable. Remplir une seringue stérile 1 mL de solution d’agar et redirigez-le sur le bord de la fenêtre pour construire un mur (Figure 2E). La solution se solidifie rapidement et reste souple pour permettre l’objectif ou l’objectif de se déplacer librement. Lorsque vous êtes prêt pour l’imagerie, supprimer la gélatine et lieu du liquide d’immersion à l’intérieur de la fenêtre pour 2p imaging (Figure 2F). Transférer l’animal stabilisé à l’intérieur de la chambre noire de 2 photons microscope et placer la fenêtre d’imagerie 2p directement sous l’objectif. Abaisser délicatement la lentille dans la fenêtre d’imagerie. 5. injection de colorant Fluorescent première et imagerie de base Préparation de 0,5 mL de Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (poids moléculaire moyen de 4 mg/mL ~ 70kDa) dans une solution saline. Remplir une seringue stérile 1 mL de la solution et raccorder la seringue sur le cathéter installé précédemment. Remarque : Préparation de la solution de colorant fluorescent avant utilisation est recommandée. Injecter le premier pigment en appuyant sur la seringue très lentement (Figure 3 b). Commencez par utiliser l’oculaire pour repérer la zone d’intérêt. Utiliser une caméra de dispositif couplé (DAC) de frais d’acquérir une image de lumineux-zone des modèles de surface des vaisseaux sanguins à plus faible grossissement comme une image de point de repère. Passer en mode numérisation laser puis ouvrez le 2p, logiciel pour la collecte de ces deux images d’imagerie et données de balayage de ligne. Choisir la bonne longueur d’onde de 2P laser excitation, la puissance et fluorescent canal (canal rouge pour le premier pigment) pour correspondre avec les fluorophores utilisés dans le tissu imagé et puis effectuer l’imagerie in vivo (Figure 3E). Garder l’animal sur un coussin chauffant pendant tout le processus. 6. C7 blessure contusion à l’aide du dispositif de LISA Effectuer une blessure de contusion de la ligne médiane C7 en utilisant un dispositif de Louisville blessure système appareil (LISA) selon un protocole établi précédemment25,26. En bref, placez l’animal sur la scène de LISA après étalonnage.Après avoir sélectionné un réglage du point zéro et ajuster le tissu déplacement (0,800 mm dans ce cas), cliquez sur le bouton de « Run Experiment » du logiciel pour déclencher la libération de l’élément de frappe et de créer le dommage. Après la blessure, placez un autre petit morceau de gélatine imbibé d’une solution saline sur le dessus de la dure-mère exposée pour le garder hydratée. Répétez l’étape 4.3 et réexécuter l’imagerie in vivo sur la même zone visible avec le colorant rouge précédemment injecté (Figure 3 & F). Transférer le dos animaux à la table d’opération chirurgicale et de garder l’animal sous sédation avec une anesthésie appropriée suivant le protocole IACUC-IUSM. 7. injection de colorant Fluorescent deuxième et l’imagerie après l’accident Préparation de 0,5 mL de fluorescéine isothiocyanate-dextran (4 mg/mL, masse moléculaire moyenne ~ 70 kDa) dans une solution saline même comme en 5.1. Remplissez la solution dans une seringue stérile 1 mL et se connecter avec le cathéter installé précédemment. Transférer l’arrière animal stabilisé à l’intérieur de la chambre noire de microscope 2P et recréer l’image sur la même zone avec la couche rouge pour le premier pigment et la couche verte pour le deuxième colorant (Figures 3D & G). À la fin de l’imagerie, libérer le rat de l’appareil de stabilisation rachidienne et nettoyer le mur de la gélose. 8. animal Sacrifice Après l’imagerie, sacrifier le rat suit le transcardial perfusion protocole27. Recueillir des échantillons de la moelle épinière et fixez-les dans 4 % PFA. 9. hors connexion Data Analysis : Quantification des diamètres de navire Transférer les fichiers d’image sur un poste de travail pour l’analyse hors ligne. Ouvrez ImageJ et sélectionnez « fichier » et ensuite choisir préalablement enregistré les données brutes et ouvrez le fichier image unique associée (Figure 4 b). Calibrer l’image en sélectionnant « Analyze » suivie de « Définir Scale » (Figure 4). La valeur placée dans « La Distance en pixels » est calculée à l’aide de l’équation affichée dans la Figure 4 a. L’étalonnage de 2 photons optique détermine la valeur par défaut dans l’équation. La valeur de « opticalZoom » se trouve dans Excel Extensible Markup Languagefile (fichier XML) associé au fichier image unique (Figure 4 b). Tracer une ligne perpendiculaire à l’axe longitudinal du bateau (Figure 41 & E1) et sélectionnez « Analyser » suivie de « Mesure ». La mesure du diamètre des vaisseaux est affichée dans la fenêtre de résultats (Figure 42 & E2). Répéter 3 fois sur le navire en vue d’acquérir de la valeur moyenne. 10. hors connexion Data Analysis : Quantification des globules rouges (RBC) Vitesse de cellules Transférer les fichiers de balayage linéaire à la station de travail pour l’analyse. Démarrez le logiciel ImageJ et sélectionnez « fichier » et ensuite choisir préalablement enregistré les données brutes et ouvrir tous les fichiers de balayage linéaire associé avec le nom de l’extension « .ome ». Ouvrez « Image » et sélectionnez « Piles » suivis par « images à empiler ». Convertir tous les fichiers de l’OME en fichier TIFF image unique pile. Démarrez le logiciel Matlab et cliquez sur « Ouvrir », sélectionnez le fichier de code « LSPIV_parallel.m ». Remarque : Le code Matlab pour LS-PIV peut être téléchargé à https://sourceforge.net/projects/lspivsupplement/files/18 Sélectionnez les ordres suivants : « Exécuter » > « Modifier le dossier » > « artère ». Choisissez le fichier TIFF de pile image généré en 10.3. Tapez « Y » et appuyez sur entrée. Placer un curseur à gauche et à droite de l’image, respectivement, et le programme commence à traiter les données. À la fin du programme, entrez 2 valeurs pour calculer la lecture finale : « valeur de conversion de pixel_meter » et « valeur de conversion de balayage-temps ». Les deux se trouvent dans le fichier XML associé aux données de balayage linéaire. La valeur finale est exprimée comme la moyenne et l’écart de vitesse dans les unités du millimètre par seconde (mm/s).