Vi indføre en i vivo billeddannelse metode ved hjælp af to forskellige fluorescerende farvestoffer til at spore dynamisk spinal vaskulære ændringer efter en contusive rygmarvsskade i voksen Sprague-Dawley rotter.
Rygmarvsskade (SCI) medfører betydelige vaskulære afbrydelse på stedet for skade. Vaskulære patologi opstår umiddelbart efter SCI og fortsætter gennem hele den akutte skade fase. Faktisk synes endotelceller at være først til at dø efter en contusive SCI. De tidlige vaskulære begivenheder, herunder øget gennemtrængelighed af blod-rygmarven barriere (BSCB), fremkalde vasogenic ødem og bidrage til skadelige sekundære skade begivenheder forårsaget af komplekse skade mekanismer. Rettet mod den vaskulære forstyrrelser, derfor kunne være en nøglestrategi til at reducere sekundære skade cascades, der bidrager til histologiske og funktionelle handicap efter SCI. Tidligere undersøgelser var for det meste udført på postmortem prøver og var ude af stand til at fange de dynamiske ændringer af det vaskulære netværk. I denne undersøgelse, har vi udviklet en i vivo duo-farve to-foton billedmetoden til at overvåge akut vaskulære dynamiske ændringer efter contusive SCI. Denne tilgang giver mulighed for påvisning af blodgennemstrømningen, fartøj diameter og andre Vaskulære sygdomme på forskellige websteder af samme rotten før og efter skaden. Samlet set giver denne metode et fremragende sted for at undersøge vaskulære dynamics.
Traumatisk rygmarvsskade (SCI) er en fælles skade fører til forringelse af motoriske, sensoriske og autonom funktion. Ifølge den nationale rygmarv skade statistiske Center (NSCISC) i 2016, ca. 282,000 personer blev ramt, mens 69% af dem var hovedsagelig som følge af trafikulykker eller falder1. Disse patienter kræve ofte intensiv pleje; men ingen effektiv behandling er tilgængelig i øjeblikket. Derfor er nye effektive strategier mod SCI tvingende nødvendigt.
SCI er primært opdelt i to faser: primær skade og sekundære skade. Den primære skade omfatter den fysiske fornærmelse forårsager blødende nekrose i stedet for virkning2, efterfulgt af en række sekundære skade begivenheder, såsom betændelse, celle apoptose og demyelinering af resterende axoner, der gradvis fører til udvidelse af morfologiske og funktionelt underskud3,4,5,6. Blødning er det første synlige tegn på skade, der angiver en umiddelbar vaskulære forstyrrelser i den akutte fase af SCI7,8. En neuroprotektive strategi med henblik på at reducere de tidlige vaskulære skader kunne forbedre patienternes opsving, men det kræver en bedre forståelse af den patofysiologiske mekanisme for tidlig efter skade vaskulære begivenheder.
Trods tidligere undersøgelser ved hjælp af forskellige metoder til at studere rygmarven Vaskulaturen, fortsat er væsentlige begrænsninger. Den mest delte ulempe er at undersøge kun postmortem prøver, for eksempel, brint regnskabsafslutning9, Autoradiografi10, microangiogram8, vaskulære korrosion kaster11og Immunhistokemi12 ,13. Selv om Laser Doppler Flowmetry giver noninvasive real-time overvågning af rygmarven blod flow14, er det ude af stand til at skelne mellem vaskulære systems og opdage vaskulære morfologiske ændringer. Dynamisk kontrast-forstærket MRI (DCE-MRI) er også noninvasive, men det skaber billeder i lav opløsning og kræver en dyre infrastruktur15.
Selv om i vivo billeddannelse ved hjælp af 2-foton laser scanning mikroskopi (2 P-LSM) er blevet udviklet for at studere vasodynamics i cortex16,17,18, et begrænset antal undersøgelser har demonstreret vaskulære ændringer efter en SCI. Tang et al. har vist ændringer i blodgennemstrømningen i udkanten af webstedet læsion i en hemisection model19, men imaging efter en contusive skade er mere udfordrende af to grunde. Først, en traditionel optisk glasrude over skaden site ville ikke fastholde den mekanisk påvirkning og forblive funktionelle for billeddannelse. Andet, udsivning af tracer i parenkym grund blødning skaber vanskeligheder med efter skade billeddannelse.
Her præsenterer vi en roman duo-farve billedbehandling metode, der tillader imaging de samme individuelle fartøjer på før og efter skade tid point. Desuden giver det en tidsmæssig-rumlige profil af vaskulære dynamiske ændringer efter en contusive SCI. Det har også potentiale for billedbehandling på flere post overtiden point. Denne protokol kan anvendes direkte på transgene dyr at studere neurovaskulære interaktion.
En udfordring for vaskulære studier efter SCI er de tekniske begrænsninger for traditionelle teknikker er stort set begrænset til vaskulære struktur ændringer i postmortem prøver. Denne roman i vivo billeddannelse ovenfor beskrevne metode giver mulighed for dynamisk måling af blodgennemstrømningen og relaterede parametre (hastighed og fartøj diameter) ved hjælp af 2 P-LSM i levende rotter. Det giver også mulighed for gentagne undersøgelse i de samme sæt af fartøjer på forskellige tidspunkter efter contusive SCI. Tidligere 2-foton mikroskopi Billeddannende teknikker har kunnet fange efter traumer vaskulære strukturer som følge af udsivning af en enkelt tracer. Vores duo-farve design giver mulighed for dynamisk vaskulære imaging for traumatisk modeller. Derudover giver fleksibilitet ved denne metode mulighed for at generere en temporal-rumlige profil af akut vaskulære ændringer efter SCI.
Der er flere kritiske trin i vores i vivo duo-farve billedbehandling metode. For det første er det afgørende at sikre den fysiske stabilitet af rygmarven før time-lapse imaging, især at reducere vejrtrækning motion artefakt. Vi har udviklet form af spinal klemmer til at øge højden af spinal ryghvirvel lidt under stabilisering. Således bevægelighed af rygmarven korrelerede vejrtrækning dyret kan være stærkt reduceret (fig. 1 d-F, 2B). Det anbefales at kontrollere stabiliteten af rygmarven før begyndelsen på hver tænkelig session. Rygmarven ikke opnå stabilitet, skal justeringen foretages til justering og tæthed af rygmarven klemmer. Andet, perifere væv (knogle, muskel lag og hud) blødning i vinduet imaging risikerer forurening af visningen. For en glat imaging session, bør gelfoam og væv klæbende lim anvendes til det omkringliggende væv for effektiv forebyggelse. Tredje, de fluorescerende farvestoffer vi vælger har samme størrelse som albumin (66 kDa), som er den vigtigste høj molekylvægt blodplasma protein. Homeostatiske betingelser, blev farvestoffer i vid udstrækning bevaret inde i fartøjet lignende som albumin28. Efter skaden, farvestofferne passeret forstyrret endotel struktur og rende ind i parenkym, forårsager en betydelig øget fluorescerende intensitet i det perifere område af Vaskulaturen (figur 3F-G). Derudover er der to grunde til, hvorfor vi vælger eksterne halsfedt kateterisation. Først, kan det give en konsekvent adgang rute levering på ethvert tidspunkt af eksperimentet. For det andet kan det bruges som en rute til fremtidige behandling injektion.
Selv om vores i vivo duo-farve metode er købedygtig levere en roman mødested for traumatisk vaskulære imaging studier, skal nogle forbehold vedrørende denne teknik behandles. I øjeblikket, denne teknik er designet til at vurdere vaskulære ændringer ved 2 tiden point (baseline og 1 efter skade tidspunkt), men det er muligt at skifte til flere tidspunkter hvis yderligere fluorescerende farvestoffer og-kanaler. Selv om der er flere undersøgelser med indopereret glasvindue for kronisk intravital imaging, kan ingen af dem giver baseline oplysninger på et og samme skib efter traumatisk skade19,29,30, 31,32. I modsætning til disse studier er vores vindue en no-glas vindue. Det er bekvemt for præ- og post skade billedbehandling, men det kan være udfordrende for genetablering af vinduet for langsigtet observation. Vores fremtidige forskning arbejder på den tekniske forbedring for kronisk billeddannelse. Det vaskulære system er sammensat af flere fartøj typer (arterie, vene og kapillær) og hver er forskellige aspekter af morfologi og funktion. Differentiering mellem fartøjet typer under imaging kunne bidrage til at drille et klart mønster af vaskulære ændringer. Den ovennævnte protokol afhænger observatør at identificere de fartøjer, der er baseret på morfologi og hastighed; dog kan en arterie-specifikke farvestoffet tilføjes nemt for at give en mere definitiv klassificering mellem fartøjet typer33.
Denne teknik er ikke kun begrænset til vurderinger af contusive og andre traumatiske modeller, såsom crush skade og stråling skade, men også på undersøgelser fokuserer på forstyrrelse af BSCB, såvel som vaskulær permeabilitet ændringer. Udover SCI, kunne det bruges til at studere de vaskulære ændringer efter andre neurodegenerative sygdomme som Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og multipel sklerose (MS). Det kunne desuden være overføres til en transgene dyr model til at studere den dynamiske neurovaskulære interaktion. Som en kraftfuld screeningsværktøj, kunne fremtidige undersøgelser udnytte den Billeddannende teknik beskrevet her til at vurdere effektiviteten af behandling for rygmarvsskade.
Konklusion, er i vivo duo-farve metode en pålidelig, real-time, i vivo tilgang værktøj til vurdering af dynamiske vaskulære ændringer, som er ideel til karakterisering af tidsmæssige-rumlige vaskulære profil og screening for behandlinger til reducere sekundære skader efter SCI.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet i en del af NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562, Merit anmeldelse Award I01 BX002356 fra US Department of veterananliggender, Craig H Neilsen Foundation 296749, Indiana rygmarv og hjerne skade Research Foundation ( ISCBIRF) af Indiana State Department of Health (019919), og Mari Hulman George Endowment midler.
Purdue Products Betadine Surgical Scrub | Fisher Scientific | 19-027132 | Skin sterilization |
Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg) | Patterson Veterinary | 07-881-9413, 07-890-5745 | Anesthetic agent |
Buprenorphine(0.03 mg/mL) | Patterson Veterinary | 07-891-9756 | Pain relief agent |
Carprofen | Patterson Veterinary | 07-844-7425 | Non-steroidal anti-inflammatory drug |
Dukal Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-490 | Skin sterilization |
Decon Ethanol 200 Proof | Fisher Scientific | 04-355-450 | Skin sterilization |
Artificial Tears Eye Ointment | Webster Veterinary | 07-870-5261 | Prevent drying eyes |
Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 1006015 | |
Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average mol wt 70kDa |
Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | Average mol wt 70kDa |
Instrument Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-50 | for sterilizing surgery tool |
Spine stabilizer set | Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute | Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com) |
|
Vetbond | 3M Animal Care Products | 1469SB | Tissue adhesive Glue |
Gelfoam | Henry Schein | 9083300 | Stop bleeding |
Noyes Spring Scissors | F.S.T | 15013-12 | |
Fine Forceps- Dumont #5 | F.S.T | 11254-20 | |
Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | laminectomy |
Surgical Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | skin cut |
Scalpel Blade #15 | Royal-Tek | BS2982 | skin cut |
micro angled scissors | World Precision Instruments | 500260 | Can be from any vendor |
3-0 vicryl sutures | Ethicon | J393H | Can be from any vendor |
1ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200.V0 | Can be from any vendor |
21 gauge needle | BD | 305165 | Can be from any vendor |
Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Can be from any vendor |
Two-photon Laser Scanning Microscope | Bruker Fluorescence Microscopy | ||
LISA device | Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute | Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com) |
|
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
HCImage Live | Hamamatsu Corporation | Imaging software | |
PrairieView | Prairie Technologies/Bruker | Two-photon imaging software | |
ImageJ | Image analysis software | ||
Matlab statistics toolbox | The MathWorks, Inc. | https://www.mathworks.com/products/statistics.html?s_tid=srchtitle | Image analysis software |