ויזואליזציה של האקסון Thalamocortical הסתעפות, סינפסה-צורה Organotypic Cocultures
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטת הדמיה סימולטני של thalamocortical האקסון מסעף סינפסה היווצרות של organotypic cocultures של תלמוס, קליפת המוח. Thalamocortical בודדים אקסונים ומסופי presynaptic שלהם הם דמיינו ידי טכניקה אלקטרופורציה תא בודד עם DsRed ו מתויג GFP synaptophysin.
Abstract
האקסון מסעף סינפסה היווצרות הן תהליכים חיוניים להקמת מעגלים עצביים מדויק. במהלך הפיתוח, אקסונים סנסוריים thalamocortical (TC) טופס סניפים, הסינפסות בשכבות ספציפיות של קליפת המוח. למרות קורלציה מרחבית ברורה בין אקסון מסעף סינפסה היווצרות, הקשר הסיבתי בין אותם ממעטים להבין. כדי לטפל בבעיה זו, לאחרונה פיתחנו שיטת הדמיה סימולטני של הסתעפות סינפסה היווצרות של אקסונים TC בודדים ב- organotypic cocultures.
פרוטוקול זה מתאר שיטה אשר מורכב של שילוב של organotypic coculture ושל אלקטרופורציה. Organotypic cocultures של תלמוס, קליפת המוח להקל על מניפולציה ג’ין והתבוננות של תהליכים עצב, שימור מבנים אופייניים כגון תצורת למינריות. שני פלסמידים שונים קידוד DsRed ו מתויג EGFP synaptophysin (SYP-EGFP) היו transfected משותפת למספר קטן של נוירונים דפנות התלמוס על ידי טכניקת אלקטרופורציה. שיטה זו אפשרה לנו לדמיין מורפולוגיות עצב בודדים של נוירונים TC ואתרים presynaptic שלהם בו זמנית. השיטה זמינה גם תצפית לטווח ארוך אשר חשף את הקשר הסיבתי בין אקסון מסעף סינפסה היווצרות.
Introduction
התחזית thalamocortical (TC) במוח של יונקים היא מערכת מתאימה לחקור מנגנוני הדרכה האקסון ומיקוד. במהלך הפיתוח, אקסונים סנסוריים TC לגדול צלחת בקליפת המוח, ואת הטופס סניפים, הסינפסות מעדיפים בתוך שכבה IV של אזורי החישה העיקרי קליפת המוח1,2. גם לאחר הקמתה של חיבורי היסוד, עצב ובשבילים ומסופי סינפטית הם השתקם בהתאם שינויים סביבתיים3,4. עם זאת, איך TC האקסון המורפולוגיה היא שונה באופן דינמי הוא ממעטים להבין. אחת הסיבות העיקריות היא חוסר טכניקה נאותה לבחון שינויים מבניים ברמה תא בודד. למרות ההתפתחויות האחרונות במיקרוסקופ, כגון מיקרוסקופ שני הפוטונים, אפשרו בהתבוננות ישירה של החיים נוירונים בקליפת המוח ויוו, ישנן מגבלות טכניות עדיין עבור לכידת הכוללת TC מסלולים5, 6. לכן, במבחנה שיטות הדמיה חיה של אקסונים TC יספק כלים רבי-עוצמה עבור ניתוח מבנה של האקסון מסעף סינפסה היווצרות.
הקבוצה שלנו בפעם הראשונה הוקמה שיטה התרבות פרוסה סטטי עם קרום חדיר7. באמצעות שיטה זו, פרוסה קורטיקלית חולדה היה cocultured עם בלוק דפנות התלמוס חושית, חיבורים TC פרופריה ספציפי היו recapitulated הזה7,cocultures organotypic8. תיוג דליל עם החלבון הניאון עוד מותר לנו להתבונן סניף היווצרות9,10,11וצמיחה של האקסון TC. לאחרונה, פיתחנו שיטה עבור הדמיה סימולטני של הסתעפות, סינפסה היווצרות אקסונים TC בודדים ב- organotypic cocultures12. להמחיש TC אקסונים ואתרים presynaptic בו זמנית, DsRed ו מתויג EGFP synaptophysin (SYP-EGFP) היו transfected משותפת למספר קטן של נוירונים דפנות התלמוס מאת אלקטרופורציה של coculture organotypic. השיטה הנוכחית מקלה על ניתוח מורפולוגי של אקסונים TC ומאפשר התבוננות ארוכת טווח, אשר יכול לשמש כדי להראות את הקשר הסיבתי בין אקסון מסעף סינפסה היווצרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול הנוכחי הוא גם כלי רב עוצמה כדי ללמוד היבטים התפתחותיים של גידול אקסונים אחר מאשר של ה TC הקרנה11. למשל, שילוב של תרבות פרוסה קורטיקלית, הטכניקה אלקטרופורציה מאפשר להמחיש מורפולוגיה עצב בודדים של נוירונים בקליפת המוח, לטווח ארוך תצפית9,18…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים גם גבריאל היד לקריאה ביקורתית.
Materials
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Hanks’ balanced salt solution (HBSS) | Nissui | 5905 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30396-03 | Hyclone |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| Sodium selenite | Wako Pure Chemical Industries |
192-10843 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries |
16806-25 | |
| 35 mm petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Millicell-CM insert | Millipore | PICMORG50 | |
| 100 mm petri dishes | BIO-BIK | I-90-20 | petri dish sterrile |
| HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
| Disposable sterile plastic pipettes | 202-IS | transfer pipets sterile | |
| Glass capillary: OD 1.2 mm | Narishige | G-1.2 | inner diameter, 1.2 mm |
| Silver wire: 0.2 and 1 mm | Nilaco | AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm) | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| Stimulator | A.M.P.I | Master 8 | |
| Biphasic isolator | BAK ELECTRONICS | BSI-2 | |
| Amplifier | A-M Systems | Model 1800 | |
| Oscilloscope | Hitachi | VC-6723 | |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Micromanipulator | Narishige | MO-10 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ40 | |
| Universal stand | Olympus | SZ-STU2 | |
| Light illumination system | Olympus | LG-PS2, LG-DI, HLL301 | |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Digital eclipse C1 laser | |
| x20 objective | Nikon | ELWD 20x/0.45 | |
| Culture chamber | Tokai Hit | UK A16-U | |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Japan SLC and Nihon-Dobutsu | ||
| Microsurgery scissors | Natsume | MB-54-1 |
References
- Kageyama, G. H., Robertson, R. T. Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis. J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).
- Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. Thalamocortical development: how are we going to get there. Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).
- Espinosa, J. S., Stryker, M. P. Development and plasticity of the primary visual cortex. Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3 (8), 272 (2005).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. Dendritic spine dynamics. Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations. Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).
- Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures. J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).
- Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching. J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).
- Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices. Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).
- Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity. Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).
- Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures. Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).
- Molnar, Z., Blakemore, C. Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture. Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).
- Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).
- Yamamoto, N., et al. Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons. J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).
- Yamamoto, N., et al. Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons. J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).
- Ohnami, S., et al. Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching. J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).
- Yamada, A., et al. Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).
