ניתוח של תאים חיסוניים העצבים ממוגלה יחיד, גנגליון העזוב השורש של עכבר אחת באמצעות Cytometry זרימה

תאי המערכת החיסונית אשר להזין את מערכת העצבים ההיקפית של מחזור הדם, כפי שהוגדר על-ידי הביטוי של CD45, CD11b, לעזור לשמור על היושרה של העצב לשחק תפקיד שני התחדשות והתנוונות¹. מקרופאגים (המוגדר על ידי הבעת רגשותיהם CD68 עכבר) יכול להיות מוטה כלפי פנוטיפ דלקתיות, ביטוי MHC יותר מחלקה II ו- CD86 על פני השטח (M1), או לכיוון פנוטיפ אנטי דלקתיות, לבטא יותר CD206 תאיים (M2)² . הטיית של פנוטיפ מקרופאג הוא תהליך דינמי מוסדר באמצעות Akt איתות³, המשקף את הפעילויות השונות של מקרופאגים ההגנה נגד פתוגנים (M1) ואת התפקיד בהתחדשות רקמות (M2). חידוש העצב הפגוע דורשת קודם phagocytosis של המיאלין פסולת על ידי מקרופאגים עצב^4,5, וכן אנטי דלקתיות (CD68⁺CD206⁺) M2 מקרופאגים הוכחו לקדם את האקסון תוצר ב מערכת העצבים ההיקפית⁶. למצב של גיוס או מקרופאגים, מערכת העצבים ההיקפית, או יכולת ראייה phagocytosis עלול לגרום התחדשות לקוי ותחזוקה של תקינות עצב. דלקתיות מקרופאגים M1, ביטוי MHC class II, פחות מסוגל phagocytosis מאשר M2 מקרופאגים, הייתה שם דלקת עצביים בפתוגנזה של מחלות ניווניות מספר⁷.

השינויים המתרחשים המערכת החיסונית תושב העצבים כתוצאה מכך נזק יכול להיות כמותיים, מפגין לאובדן CD45⁺ לויקוציטים (או גדל חדירה של CD45⁺ לויקוציטים הדלקת במקרה), או איכותיים, כגון שנה של פנוטיפ מקרופאג מ M2 M1 פנוטיפ. תאים חיסוניים של מערכת העצבים ההיקפית יש באופן מסורתי נותחו באמצעות IF, באמצעות סעיפים קפוא או פרפין-מוטבע גשמי⁸. אם נדרשת עבור קביעת לוקליזציה של התאים של ריבית. עם זאת, כימות באמצעות אם לעיתים קרובות מסתמך על ספירת מספר קטן יחסית של תאים בקטע הצר של הרקמה, ביצוע כימות לא אמין ופגיעה הטיית בחירה. עבור זיהוי של הנדונים של תאים חיסוניים, זיהוי סמנים חוץ-תאית ו/או תאיים סימולטני נדרש, תוך קביעת פנוטיפ מקרופאג דורש לפחות לפחות שני סמנים, במיוחד CD206 ו- MHC class II. כמו לרוב מיקרוסקופים זמין מוגבלות לערוצי לפחות שני צבעים, כגון fluorescein isothiocyanate (FITC) phycoerythrin (PE), אפיון הנדונים של תאים חיסוניים מאת אם יכול להיות מגבילים ולא שלמים, הדורשים הצורך לקחת מספר שקופיות, נגזר באותו האזור של הריבית, אשר הם כתמים וניתח במקביל. היבט זה זמן רב ולכן אינו הכרחי מרשה לעצמו הניתוח של ערכות מדגם גדולים. יתר על כן, כמו רוב הקריטריונים של עניין הם חוץ-תאית, הזיהוי ברקמות, אשר יש גם להיות מוטבע בתוך פרפין או cryoconserved, עשויה להיות בעייתית עקב שיבוש הקרומיות, המסיכה של epitopes, כמו גם על אובדן האנטיגנים של עניין משימוש של ממיסים, כגון אצטון, מתנול⁹.

לעומת זאת, flow cytometry, אשר מודד אופטי, קרינה פלואורסצנטית מאפייני תאים בודדים ההשעיה כשהם עוברים דרך קרן של אור, מספק אמצעים מעשיים וכוללת יותר לניתוח של אוכלוסיות תאים. Cytometry זרימה, במקום לייצר תמונה דיגיטלית של הרקמה, מספק של כימות פרמטרים שהוגדרו, הכוללים אינדקס רפלקטיביים, המכונה הפיזור קדמי (FSC), צפיפות רשת/פנימיות מורכבות ובגודל היחסי של התא אוטומטיות או לוואי-פיזור (האס), עוצמת קרינה פלואורסצנטית היחסי, מתן כי התא יש כבר עם תוויות של fluorophore המתאים, כגון נוגדן מצומדת. Cytometer זרימה טיפוסית מורכבת שני, לייזרים מקורר; ללייזר מייצרת אור כחול-488 ננומטר, לייזר הליום-ניאון מייצרת אור-633 ננומטר. שילוב זה מאפשר זיהוי, מדידה, בו זמנית, לפחות חמש מטרות או על פני השטח או בתוך תא תאיים. Cytometers זרימה מתקדמות יותר יכולה להיות מורכבת מרובים לייזרים, אשר מאפשרים זיהוי עד שמונה fluorochromes שונים בעת ובעונה אחת, מתן כי שיא פליטת אורכי הגל של fluorochromes שנבחרו אינם חופפים באופן משמעותי.

ניתוח על ידי cytometry זרימה, הרקמה עניין חייב קודם enzymatically ובינינו, בדרך כלל עם collagenase, כדי ליצור השעיה תא בודד. הניתוח של העצבים ממוגלה מאתר בעבר היה קשה בגלל כמות קטנה של רקמת המתקבל בכל עכבר. בנוסף, תכולת שומן גבוהה של המיאלין סביב האקסונים הסלים תא התאוששות ומייצר כמויות גדולות של פסולת. השיטה המתוארת במסמך זה עבור הכנה בעצב ועיכול הותאם פרוטוקול בידוד תאי שוואן הסיכה. et al. ⁷, שואפת לבודד מספיק תאים מן העצבים של עכברים בודדים לניתוח cytometry זרימה, על מנת להפחית וריאציה בין עכברים. באמצעות דאפי לצורך זיהוי תאים בודדים בשיטה digest רקמות raw עוקף את הצורך להסיר האקסון פסולת, מה שמוביל בדרך כלל איבוד תאים. כביסה מספר פעמים עם איידס מאגר עשיר דטרגנט במהדורה של תאים לכוד בתוך ההריסות שומן, ובכך מגדיל את התשואה. מערכת העיכול של שני עצבים ממוגלה באורך מלא של עכבר אחת לפי פרוטוקול זה יוצר ≥30, 000 אירועים nucleated יחיד, לפחות 3 פעמים את המספר אוחזרה הרפובליקה. חלקם של CD45⁺ לויקוציטים היה כ- 5% של תוכן התא סך הכל ב”דייגיסט בעצב, כ 5-10% בשיטה DRG digest. הרוב המכריע של CD45⁺ תאים בעצב הביע את סמני macrophage, CD68 ו- CD206.