Mettede fettsyrer indusere celledød Ceramide-assosiert Macrophage
Summary
Vi illustrerer en rett fram metode til å utlede murine primære makrofager fra benmargen celler og en enkel metode å forberede BSA-fettsyrer conjugates. Deretter viser vi at mettede fettsyrer kan indusere macrophage celledød, og slike celledød er positivt assosiert med mobilnettet akkumulering av ceramide nivåer.
Abstract
Makrofager uttrykke svært epidermal fettsyrer-bindende protein og adipose fettsyrer-bindende protein. De aktivt opptak mettet og umettede fettsyrer, som kan spille en avgjørende rolle i å regulere deres immun funksjoner. Mange studier har vist at ulike fettsyrer, mettet eller umettede, kan ha ulike virkninger på cellevekst og funksjon. Men varierer tilnærmingene brukt for fettsyrer forberedelse, som kan føre til ikke-fysiologiske resultater. Serum albumin, en naturlig operatør for fettsyrer i pattedyr perifert blod, anbefales for å danne en konjugert med salt natrium fatty syren å studere fettsyrer funksjon i pattedyrceller, således minimere toksisitet av fettsyrer såpe. Dermed er en enkel, relativt rask oppvarming og sonicating metoden utviklet og presenteres her for BSA fatty acid konjugat formasjonen. Vi beskriver en protokoll som mettede fettsyrer, spesielt sted syren å indusere alvorlig celledød i musen benmarg avledet makrofager. Videre viser vi at mettede fettsyrer-indusert celledød er positivt assosiert med akkumulert mobilnettet ceramide nivåer. Denne metoden kan utvides for studier av effekten av fettsyrer på andre pattedyrceller.
Introduction
Fettsyrer spille en avgjørende rolle i energi metabolisme og syntese av membran fosfolipider i forskjellige celler. Fettsyrer har en lav vandig oppløselighet. Aktuelle utarbeidelse av fettsyre er av avgjørende betydning for å studere biologiske funksjoner av fettsyrer i pattedyrceller. Når fettsyrer er forberedt med etanol, kan mange fettsyrer viser deres giftige såpe (vaskemiddel) effekt på cellemembranen, selv i relativt lave konsentrasjoner1. Som en naturlig, store transporter for frie fettsyrer i serum, serum albumin er ansett som en god transportør for fettsyrer levering i vitro fettsyrer funksjonen analyser2,3,4. Detaljer om utarbeidelse av fettsyre og serum albumin konjugert er imidlertid vanligvis ikke tilgjengelig selv om mange oppgaver ved hjelp av fettsyrer har blitt publisert.
Makrofager uttrykke svært epidermal fettsyrer-bindende protein og adipose fettsyrer-bindende protein5,6,7,8. De aktivt opptak mettet og umettede fettsyrer som kan regulere deres immun funksjoner. For å studere virkningen av fettsyrer makrofager og andre celler, var forskjellige metoder for fettsyrer forberedelse anvendt1,7,9. Bruke riktig forberedt fettsyrer/serum albumin conjugates for å undersøke virkningen av fettsyrer på macrophage funksjon er av avgjørende betydning i å skaffe biologisk meningsfull data. Studier av effekten av fettsyrer på macrophage funksjon kan gi grunnleggende kunnskaper og potensielle terapeutiske mål knyttet til metabolismen av fettsyrer i macrophage-involvert sykdommer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Riktig utarbeidelse av fettsyre løsning er av avgjørende betydning å studere biologiske funksjonen av fettsyrer. Nøytralisering av fettsyrer øker løselighet i vandig løsning. Natrium salter av fettsyrer, spesielt mettede fettsyrer, er imidlertid fortsatt av lav oppløselighet i vann eller PBS vi observert. En metode er å bruke 95-100% etanol til å oppløse fettsyrer1. Bruker denne metoden, kan høyere toksisitet celler sees selv i lave konsentrasjoner for mindre giftige umettede fettsyrer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble delvis støttet av universitetet i Louisville oppstart midlene og National Cancer Institute (Bethesda, MD) gir R01CA177679, R01CA180986.
Materials
| CPX Ultrasonic Bath | Bransonic | Model 2800 | |
| Sodium palmitate (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Sodium stearate (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF) | Cell Signaling Technology, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM) | Sigma | C8104-50TST | Clone: MID 15B4 |
| Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate | Sigma | AP128F | |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | |
| Permeabilization buffer | Ebioscience | 4307693 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| L929 cells | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Cell Lifter | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Note: M.W. is for molecular weight. |
References
- Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
- Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis. J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).
- Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity. Shock. , (2017).
- Vusse, G. J. Albumin as fatty acid transporter. Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).
- Zhang, Y., et al. Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production. J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).
- Zhang, Y., et al. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet. Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).
- Wen, H., et al. Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling. Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).
- Zhang, Y., et al. Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages. Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).
- Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. , (2008).
- Dansen, T. B., et al. High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2). Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).
- Ulloth, J. E., et al. Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death. Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).
