DNA kleuring methode gebaseerd op Formazan neerslag veroorzaakt door blootstelling aan blauw licht
Summary
Met deze methode kunt selectieve kleuring en kwantificering van DNA in gels door inweken de gel in een groene SYBR ik / Nitro blauwe Tetrazolium oplossing en vervolgens blootstelling aan zonlicht of een blauwe lichtbron. Dit produceert een zichtbaar neerslag en bijna geen apparatuur, waardoor het ideaal is voor gebruik van veld vereist.
Abstract
DNA kleuring methoden zijn zeer belangrijk voor biomedisch onderzoek. We ontwierpen een eenvoudige methode waarmee DNA visualisatie met het blote oog door de vorming van een gekleurde neerslag. Het werkt door het onderdompelen van de acrylamide of DNA agarose gel in een oplossing van 1 x (equivalent aan 2,0 µM) SYBR Green ik (SG ik) en 0,20 mM nitro blauwe tetrazolium die produceert een paars neerslaan van formazan bij blootstelling aan zonlicht of specifiek blauw licht. Ook werden DNA-herstel-tests uitgevoerd met behulp van een ampicilline-resistentie plasmiden in een agarose gel bevlekt met onze methode. Een groter aantal kolonies werd verkregen met onze methode dan met traditionele kleuring met SG ik met ultraviolet verlichting. De beschreven methode is snel, specifieke en niet-toxisch voor de detectie van DNA, waardoor de visualisatie van biomoleculen met het “blote oog” zonder een transilluminator, en is goedkoop en geschikt is voor gebruik van het veld. Om deze redenen heeft onze nieuwe DNA kleuring methode potentiële voordelen voor zowel onderzoek en industrie.
Introduction
Met de vooruitgang in de biochemie en moleculaire biologie moeten de studies waarbij DNA betere technieken voor het analyseren van DNA. De eerste methode voor DNA kleuring was zilver vlekken, die zeer gevoelig is maar mist selectiviteit en monster herstel niet mogelijk. Later, toegestaan de ontwikkeling van fluorescente DNA kleuring de selectieve kwantificering van DNA met de mogelijkheid van herstel van de steekproef. Een van de eerste fluorescente kleurstoffen gebruikt voor DNA kwantificering was ethidium bromide (en)1, die is mutageen2. Echter, nu zijn er betere fluorescente kleurstoffen die veiliger en gevoeliger, zoals GelRed en SYBR groen ik (SG ik)3; maar al deze fluorescente kleurstoffen vereisen het gebruik van een ultraviolet (UV) transilluminator of fluorimeter.
Er zijn andere technieken voor de kleuring zichtbaar DNA, zoals methyleenblauw4 en kristalviolet5,6,7,8,9, maar al deze last van verminderde gevoeligheid en selectiviteit. De tetrazolium zouten zijn organische stoffen gevoelig voor vermindering, en wanneer dit gebeurt vormen ze een onoplosbaar en gekleurde formazan precipiteren10,11. Onlangs, sommige zouten bivalente tetrazolium gebleken binden aan DNA als gevolg van hun positieve tetrazolium ringen12.
In een recente publicatie13, werd een nieuwe zichtbaar techniek voor vlekken en kwantificeren van DNA in polyacrylamide gels voorgesteld, met behulp van de vermindering van een tweewaardig tetrazolium zout genaamd nitro blauwe tetrazolium (NBT) en fluorescente kleurstoffen zoals ethidiumbromide, GelRed, SYBR groene ik en SYBR goud. Deze reactie werkte in het bijzijn van blauw licht of zonlicht en toegestaan monster herstel met verbeterde kwaliteit in vergelijking met het gebruik van SG ik met een UV-transilluminator. Het doel van deze paper is om een gedetailleerd protocol van de kleuring techniek met behulp van tetrazolium zouten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een gevoelige en roman DNA kleuring methode gebaseerd op de vermindering van de NBT en het gebruik van SG ik werd gepresenteerd in dit artikel. De kritische stap in dit protocol is de incubatietijd van de gel in de NBT-SG ik oplossing en de concentratie van NBT. De kleuring tijd voor agarose gel is langer dan voor acrylamide gels vanwege de grotere dikte van agarose gel. Deze methode werkt niet goed in het bijzijn van de SDS zoals NBT in contact met het precipitaten. Als de gel een paarse achtergrond verkrijgt, is het aa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door Fondo Nacional de Desarrollo Científico y autonoom (Fondecyt), Chili, Project 11130263 (naar CW), Project CONICYT + NERC Programa de Colaboración Internacional PCI-PII20150073 (naar CW) en U-inicia van de Vicerrectoría de Investigación Universidad de Chile (naar CW).
Bedankt aan Tatiana Naranjo-Palma voor de hulp in de eerste fase van dit Project, Dr. Jorge Babul en Diego Quiroga-Roger voor nuttige discussie, Robert Lesch voor de herziening van het manuscript en de Dirección de extensión de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas van Universidad de Chile. Dank ook aan Marcelo Pérez voor het bewerken van de video en Neil Stevens voor het corrigeren van de tekst en Errol Watson voor het verstrekken van de voice-over.
Materials
| Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | reagent used in the staining |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | reagent used in the staining |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | used to extract plasmid from the gel in integrity assay |
| DNA ladder | Thermo-Fisher | SM 1331 | used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay |
| Agar Agar | Merck | used to make LB-ampicillin culture plates | |
| sodium chloride | Merck | 1064045000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| yeast extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| peptone | Merck | 72161000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| TEMED | AMRESCO | 761 | used to make polyacrylamide gels |
| ammonium persulfate | Calbiochem | 2310 | used to make polyacrylamide gels |
| acrylamide | invitrogen | 15512-023 | used to make polyacrylamide gels |
| bisacrylamide | SIGMA | 146072 | used to make polyacrylamide gels |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | used to make TAE buffer |
| Acetic acid | Merck | 1,000,632,500 | used to make TAE buffer |
| agarose | Merck | 16802 | used to make TAE buffer |
| spectrophotometer | Tecan | infinite 200 pro | used to quantify DNA plasmid |
| water purificatiom unit | Merck | Elix 100 | use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions |
| distilled water | – | used in gels, culture medium, stainings and general solutions | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| 6X DNA loading dye | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Blue LED | Jinyuan electronics | SP-021 | light source used in integrity assay |
| protoboard | KANDH | KH102 | light source support and circuit |
| 9 V battery | Duracell | – | used to power the LED's |
| horizontal electrophoresis chamber | Biorad | 1704486EDU | used to make and run agarose gel in integrity assay |
| vertical electrophoresis kit | Biorad | 1658002EDU | used to run polyacrylamide gels in calibration curves |
| power supply | Biorad | 1645050 | used to power the electrophoresis |
References
- LePecq, J. B., Paoletti, C. A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization. J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).
- Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).
- Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels. Biophys. J. 66 (A150), (1994).
- Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).
- Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange. Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).
- Yang, Y. I., et al. Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels. Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).
- Santillán-Torres, J. L. A novel stain for DNA in agarose gels. Trends Genet. 9 (2), 40 (1993).
- Adkins, S., Burmeister, M. Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations. Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).
- Cong, W. T., et al. A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet. Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).
- Altman, F. P. Tetrazolium salts and formazans. Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).
- Nineham, A. W. The chemistry of formazans and tetrazolium salts. Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).
- Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).
- Paredes, A. J., et al. New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts. Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (2012).
- Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor. Cell. 45 (3), 397-406 (1986).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. . Brock biology of microorganisms. , (2003).
