Caractérisation des Polysaccharides pariétaux Mannan chez les plantes à l’aide de rythme

1. récolte du matériel végétal récolte des végétaux frais (environ 20 mg) et immédiatement il plonger dans de l’éthanol 96 % (v/v) et incuber à 70 ° C pendant 30 min ; Ceci désactive toute dégradant les enzymes présentes les parois cellulaires. Pour les matériaux secs, commencez à l’étape 2. ATTENTION : L’éthanol est inflammable. Remarque : Une seule feuille de souches ou rosettes fournira assez de matériel pour l’analyse. Toutefois, moins d’erreurs surviennent si une grande quantité de tissu est regroupée et analysée puisque c’est plus facile de peser et de gérer. Enregistrer soigneusement le type de tissu et stade de développement, comme structure polysaccharidique varie avec les deux. Par exemple, avec Arabidopsis thaliana (utilisé ici), étape du tissu selon les méthodes de Boyes et al. 15 Remarque : dans ce protocole, nous avons utilisé la moitié inférieure de la tige de l’inflorescence, où le premier silique est entièrement allongé mais ne pas de jaunissement. 2. résidu Insoluble préparation de l’alcool (AIR) Prepare AIR, suivant la méthode de Mortimer et al. 9 ou autre méthode similaire, afin de produire une poudre manque de sucres solubles, tels que le saccharose et amidon. 3. Aliquotage et avant le traitement de l’AIR Remarque : la quantité d’AIR nécessaire pour chaque échantillon dépendra de (a) l’abondance du polysaccharide d’intérêt dans le matériel et (b) la taille moyenne des oligosaccharides sorti exacte la GH. La méthode ajoute une seule molécule fluorescente à l’extrémité réductrice de chaque oligosaccharide, afin que le nombre des oligosaccharides détermine la sensibilité de l’expérience. Comme ligne directrice, de glucomannane dans Arabidopsis tige digéré avec GH5/GH26 (comme décrit), 500 µg est recommandé 11, tandis que pour le xylane dans Arabidopsis tige digéré avec GH11, 100µg est recommandé comme dans Mortimer ' étude s 3. peser AIR (10-15 mg) dans un tube à centrifuger de 15 mL et ajouter H 2 O à une concentration finale de 2 mg/mL. Vortex pour obtenir une suspension de même. Si cela pose problème, puis utilisez un verre homogénéisateur pour aider ce processus. Aliquot 500 µg dans des microtubes tubes. Sécher les parties aliquotes à l’aide d’une centrifugeuse à vide (voir la Table des matières) durant la nuit à 30 ° C. AIR prétraiter avec 1 NaOH M (20 µL) pendant 1 h à température ambiante ; ceci hors acétyle les polysaccharides et gonfle les microfibrilles de cellulose, perturbant la structure de la biomasse et permettant l’accès de GH. Remarque : Cette étape peut être sautée pour polysaccharides purifiées. ATTENTION – acide/base forte. Comprennent une partie aliquote d’un contrôle d’AIR non-enzyme (le même traitement que tous les échantillons, sauf le point 4.1. est exclu). Ajouter 200 µL d’H 2 O et 20 µL 1 M HCl à neutraliser. Test que le pH est environ 6-7 en enlevant 1 µL et il spotting sur bandes de papier pH indicateur. Ammonium de 1 M ajouter 50 µL de tampon d’acétate, pH 6.0 (ou n’importe quel pH est approprié pour le SGH utilisé dans l’étude) et H 2 O pour obtenir un volume total de 500 µL. Remarque : Acétate d’Ammonium est utilisé puisqu’il se sublime après séchage, et donc il n’ajoute pas de sel supplémentaire à l’échantillon. Un excès de sel peut conduire à la mauvaise forme de bande et de la résolution sur le gel de l’APCE. 4. Hydrolyse d’AIR avec Glycosyl Hydrolases (GHs) Remarque : comme indiqué dans la Discussion, la pureté du SGH est critique. L’utilisation seule façon hétérologue exprimées, affinité purifié des enzymes. Dès réception de chaque lot du fabricant, hydrolysent aliquotes définies du substrat (par exemple, 500 µg AIR) avec des quantités croissantes de GH pendant la nuit (par exemple, 0,5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µL) (3 unités/µL). Quand il y a un excès de GH, l’empreinte de rythme cherchera identique. Un excès d’enzyme est tenu de produire un résultat reproductible car il doit être certain que la réaction d’hydrolyse est proche du point de terminaison. Contrôle Ajouter un montant prédéterminé (voir ci-dessus) de mannanases ( 11 GH5 et GH26) pour les aliquotes d’AIR dans le tampon de l’étape 3.5, mais aussi un positif (30 µg de glucomannane de konjac) et un témoin négatif no-AIR (mélange enzymatique dans une tube vide). Vortex et un essorage puis brièvement pour rassembler le mélange réactionnel dans le fond du tube. Incuber une nuit à 37 ° C (ou la température appropriée pour la GH de choix) avec agitation modérée (~ 100 tr/min). Arrêter la réaction en incubant à 95 ° C pendant 20 min. Remarque : Les bouchons peuvent être utilisés pour sceller des microtubes basculant. Centrifuger utilisant une microcentrifugeuse dessus de banc à vitesse maximale pendant 10 min et conserver le liquide surnageant. Resuspendre le culot dans 250 µL H 2 O, centrifugeuse comme ci-dessus et conserver le liquide surnageant. Combiner les deux surnageants et sécher dans une centrifugeuse sous vide (voir la Table des matières) à 30 ° C (~ 3 h ou toute la nuit sans chauffage). 5. Élaboration de normes d’Oligosaccharide stock de 1 mM de préparer des solutions en H 2 O de mannose (homme), mannobiose (Man 2), libèrent (Man 3), mannotétraose (Man 4), mannopentaose (Man 5) et mannohexaose (Man 6), tous les β, 1-4 lié. Aliquote et conserver à-20 ° C jusqu’à leur utilisation. Préparer 3 concentrations différentes d’un homme 1-6 mélange en combinant 1 µL (Standard S1), 2 µL (S2) ou 5 µL (S3) tous les six. Sec dans une centrifugeuse sous vide (voir la Table des matières) à 30 ° C (~ 1 h). 6. Dérivé d’Oligosaccharides Prepare une solution mère de fourmis de 0,2 M (8-aminonaphthalènes-1,3,6-trisulfonique acide) dans H 2 O : acide acétique 17:3. Stock chaude à 60 ° C, jusqu’à dissolution complète du solide. Conserver à-20 ° C, abri de la lumière pendant 2-3 mois. Préparer une solution 0,2 M du 2-picoline borane (2-PB) dans le DMSO. C’est extrêmement hygroscopique, resuspendre immédiatement toute la poudre à la réception dans le DMSO. Aliquote et les conserver à-20 ° C pendant 1 à 2 ans. Décongeler les aliquotes comme requis (magasin à 4 ° C pendant 2 semaines et puis jeter). Préparer le tampon de dérivatisation de H 2 O : acide acétique : DMSO à 17:03:20. Pour chaque échantillon, ajouter 5 µL de fourmis, 5 µL de 2-PB et 10 µL de tampon de dérivation. Essorage brièvement pour s’accumuler dans le fond du tube, vortex soigneusement et puis tourner de nouveau brièvement. Voir la Figure 1 pour une description de la réaction. Échantillons incuber une nuit à 37 ° C, abri de la lumière. Sec dans une centrifugeuse sous vide (voir la Table des matières) à 30 ° C (~ 2 h). Remettre les échantillons et standard dans 100 µL 3 M d’urée. Conserver à-20 ° C, abri de la lumière jusqu’à ce que nécessaire. 7. Préparation de l’APCE gélifie Remarque : assemblage de l’équipement de coulage de gel va dépendre de la marque. Ici, nous avons usoi un système d’électrophorèse verticale (voir Table des matières), équipé de plaques de verre de 18 x 24 cm et 1,5 mm entretoises. Assembler des équipements de coulée de gel par le fabricant ' instructions de s. Tampon de rythme x 10 make (1 M Tris-Borate, pH 8,2) comme suit : Ajouter 121,14 g de Tris-Base à ~ 400 mL de H 2 O et mélanger pour dissoudre. Ajuster le pH à 8,2 par addition d’acide borique solide (environ 60 g) et ensuite faire volume jusqu’à 1 L. Faire un ammonium 10 % (p/v) stock de persulfate (APS) dans H 2 O. aliquote et stocker une fois à aliquotes de dégel-20 ° C., conserver à 4 ° C et jeter après 2 semaines. Faire et verser le gel résolution. Pour le matériel ci-dessus, 1 gel correspond à 50 mL. Dans un tube à centrifuger 50 mL, mélanger H 2 O (20,2 mL), 5 mL x 10 PACE tampon, 24,6 mL 40 % d’acrylamide/Bis-acrylamide (acrylamide:Bis 29 : 1). (Attention : toxique). Ajouter 200 µL d’APS et 20 µL de N, N, N, N´-tétraméthyl-éthylènediamine (TEMED). Inverser doucement pour bien mélanger (pour éviter d’introduire des bulles d’air). Verser le gel à l’aide d’un sérologique ou autre pipette de volume important, à environ 4 cm au-dessous du sommet des plaques de verre. Faites attention à la possibilité de bulles d’air se pris au piège dans le gel. Si ils faire cesser de verser et inclinaison/robinet le gel pour les libérer. Le gel avec de l’isopropanol (inflammable attention  :) ou, avec soin, avec H 2 O. Allow gel à polymériser (20-30 minutes), puis verser sur la couche supérieure de superposition. Si isopropanol a été utilisée, puis laver 2 x avec H 2 O. Dry tout excès de liquide à l’aide de papier buvard. Faire et verser le gel de concentration. Mélanger 6,8 mL H 2 O, 1 mL de tampon de rythme x 10, 2,8 mL acrylamide/Bis-acrylamide (attention : toxiques), 80 µL APS et 8 µL de TEMED dans un tube à centrifuger 15 mL. Inverser pour mélanger et superposer sur le dessus de gel polymérisé de résoudre. Insérer délicatement les peignes, en évitant les bulles d’air de piégeage sous les dents du peigne. Autoriser gel polymériser (20-30 min), enveloppement dans le tissu humide, puis dans une pellicule plastique et conserver à 4 ° C jusqu’à leur utilisation. Magasin avec les peignes en place. Remarque : L’APCE gels peuvent être stockés pour un maximum de 2 semaines (bien que moins d’une semaine est idéale), si elles sont gardées humides. 8. En cours d’exécution un rythme Gel Utilisez un marqueur permanent pour marquer les positions bien sur le verre, qui vous aideront à garder la trace de l’ordre de chargement, et à identifier où les puits sont une fois retiré le peigne. Supprimer le peigne. Remplir les puits avec du tampon de rythme de 1 x. Utiliser une microseringue µL 10 pour charger 2 µL de normes et d’échantillons dans les puits. Évitez d’utiliser les voies ultrapériphériques, qui ont tendance à courir les échantillons mal. Assembler la chambre haute de l’appareil de gel de manque d’eau et placer le gel dans une cuve en cours d’exécution refroidi (environ 10 ° C) (10 ° C) contenant 1 x tampon de rythme. Remplir la chambre supérieure avec du tampon de rythme de 1 x. Allumez la puissance et exécuter le gel à 200 V (constante V) pour 30 minutes, puis augmentation de tension jusqu’à 1000 V pour 1 h 40 min. Protéger des gels de la lumière (par exemple, en encapsulant des chars dans des sacs poubelle noirs). Remarque : Vérifiez sur les gels ~ 5 min après avoir mis la tension et puis un autre 5 minutes après l’augmentation de la tension à 1 000 V. Si le bloc d’alimentation est incapable de maintenir la tension il y a probablement une fuite de mémoire tampon. Enlever le gel de la cuve. Remonter la chambre haute, en vérifiant soigneusement mise en place de tous les joints. Une grande puce sur le bord supérieur de la plaque de verre peut empêcher la plaque formant une bonne étanchéité avec un joint. Cela peut généralement être temporairement résolu en ajoutant une goutte de gel d’agarose fondu de 5 % (p/v) à la partie écaillée de la vitre, avant d’ajouter la chambre supérieure. 9. Visualisation d’un gel de rythme Remarque : utilisez un gel d’imagerie système équipé d’ampoules UV de longueur d’onde dans la courte longueur d’onde et un filtre d’émission pour la caméra qui est adapté pour le fluorophore, ici 530 nm. Par ailleurs, un scanner laser peut également être utilisé, tel que décrit dans le Goubet 2. Assurer le gel système d’imagerie est sans poussière en l’essuyant avec le tissu pelucheux humide. Enlever le gel de la cuve de rythme et afficher brièvement alors que le gel est encore dans les plaques de verre (< 80 ms) pour déterminer si l’avant de la teinture est toujours sur le gel. Ouvrez le gel à l’aide d’un outil de coin et tandis que le gel est encore sur une vitre, utilisez un couteau à pizza pour enlever le gel de concentration et, si le front de colorant est toujours sur le gel, l’extrémité du gel. ~ 5 mL H 2 O, mettez sur la surface de la courte longueur d’onde et puis transférez le gel directement sur la courte longueur d’onde. La valeur du filtre UV 605 et allumez le transilluminateur de grande longueur d’onde UV (voir Table des matières) à l’aide du logiciel. Remarque : Le fluorophore de fourmis utilisé ici a une excitation/émission de 353/520 nm. Prendre plusieurs images à différents temps d’exposition (p. ex., 100 ms à 10 s). Veiller à ce que la lumière UV est éteint entre les images en cliquant sur le bouton lumière UV (pour désactiver) pour éviter de dégrader la fluorescence. Assurer d’avoir au moins 2 des images sans bandes saturées (le gel logiciel d’imagerie indiquera ceci). Enregistrer les fichiers sous forme d’images haute-resolution.tif. Remarque : Des Images peuvent être analysées à l’aide du logiciel fourni avec le gel, système d’imagerie, ou en utilisant le logiciel d’analyse image librement disponibles, par exemple ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Reportez-vous à la section résultats pour une analyse de la quantification.