JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
신경과학

تمايز الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في السلائف إينتيرنيورون القشرية

Published: December 03, 2017
doi:
10.3791/56358
,
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children’s Hospital of Philadelphia,University of Pennsylvania School of Medicine

Summary

ويصف هذا البروتوكول وسيلة لتوليد المتكفل إينتيرنيورون القشرية والسلائف الانقسامية بعد إينتيرنيورون من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس استخدام أسلوب الهيئة لأحادي الطبقة امبريويد معدلة. سلائف موروث يمكن أن تستخدم في المختبر أو فلوريسسينتلي فرز وزرعها في اللحاء الوليد الجديد لدراسة تحديد مصير، أو المستخدمة في التطبيقات العلاجية.

Abstract

إينتيرنيورونس القشرية جابايرجيك هي عدد سكان غير متجانسة من الخلايا التي تلعب أدواراً حاسمة في تنظيم إنتاج الخلايا العصبية الهرمية ضادات، فضلا عن تزامن نواتج الفرق العصبية الهرمية. العجز في الدالة إينتيرنيورون قد تورطت في مجموعة متنوعة من الاضطرابات العصبية، بما في ذلك مرض الفصام والتوحد، والصرع. اشتقاق إينتيرنيورونس القشرية من الخلايا الجذعية الجنينية لا يسمح للدراسة لتنميتها ووظيفة فحسب، بل يوفر نظرة ثاقبة الآليات الجزيئية الكامنة وراء الآلية المرضية للاضطرابات المتصلة إينتيرنيورون القشرية. وقد إينتيرنيورونس أيضا قدرة رائعة على البقاء على قيد الحياة والهجرة والاندماج في المضيف الدوائر القشرية بعد انتهاء الزرع، جعلها مرشحا مثاليا للاستخدام في العلاجات المستندة إلى الخلية. نقدم هنا، قابلة للتحجيم، ذات كفاءة عالية، وتعديل أسلوب الهيئة لأحادي الطبقة امبريويد للإعراب عن Nkx2.1 إينتيرنيورون المتكفل وذرياتهم من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (ميسكس). استخدام خط ©جميع مراسل مزدوج Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP، Nkx2.1 موروث أو ذرياتهم الانقسامية بعد الإعراب عن Lhx6 يمكن معزولة عن طريق تنشيط fluorescence الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) وبعد ذلك، تستخدم في عدد من التطبيقات المتلقين للمعلومات. كما نقوم بتوفير أساليب لإثراء بارفالبومين (PV) أو سوماتوستاتين (SST) إينتيرنيورون الفرعية، التي قد تكون مفيدة لدراسة الجوانب لتحديد مصير أو للاستخدام في التطبيقات العلاجية التي ستستفيد من إينتيرنيورون إثراء الفريق الفرعي عمليات الزرع.

Introduction

في كل من الفئران والبشر، تقريبا نصف عدد جميع القشرية إينتيرنيورونس المثبطة (قطرية) تنشأ داخل بنية subcortical عابر المعروف نيافة ganglionic الآنسي (MGE)، حيث المتكفل نيوروبيثيليال من قطرية وغيرها من الخلايا العصبية الدبقية مجموعات فرعية تعبر عن عامل النسخ Nkx2.11،2. يتم تعريف مجموعات فرعية CIn أو الأنواع الفرعية المتقاطعة المورفولوجية، الكيميائية العصبية، والكهربية، وربط الخصائص3،4. قطرية المستمدة من MGE يمكن تجميعها في فئات فرعية معظمها غير متداخلة استناداً إلى التعبير عنها أما PV أو درجة حرارة سطح البحر، التعبير عن الذي يرتبط مع النزعات الكهربية واتصال خاص5. خلل إينتيرنيورونس، لا سيما تلك الموجودة في الفريق الفرعي الكهروضوئية، كان متورطا في عدة العصبية اضطرابات وأمراض6،7. والهدف العام لهذا الأسلوب إنتاج المستمدة من الخلايا الجذعية المتكفل الانقسامية والسلائف المهاجرة إثراء لمصير الكهروضوئية أو SST CIn لدراسة البيولوجيا إينتيرنيورون القشرية ولاستخدامها في العلاجات المستندة إلى الخلية.

قمنا بتطوير أسلوب للتحجيم، ذات كفاءة عالية للإعراب عن Nkx2.1 إينتيرنيورون المتكفل وذرياتهم من ميسكس. استخدام Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP مراسل المزدوج مسك خط8، Nkx2.1 موروث أو يمكن معزولة عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية ذرياتهم الانقسامية بعد الإعراب عن Lhx6 وبعد ذلك، تستخدم في عدد من التطبيقات المتلقين للمعلومات. عن طريق التلاعب في عدد من مسارات الإشارات، والمدة للثقافة، ووضع للخلايا، يمكننا الحصول على ملايين سلائف إينتيرنيورون المسمى فلوريسسينتلي مناسبة لمجموعة كبيرة من التطبيقات المتلقين للمعلومات.

وبالرغم من وجود عدة طرق أخرى لتوليد مثل MGE موروث من ميسكس9،10،11،12،،من1314، لدينا أسلوب، والذي يعتمد على Wnt خصم XAV-939، كفاءة خاصة في توليد Foxg1/Nkx2.1 المشترك معربا عن موروث تيلينسيفاليك. وباﻹضافة إلى ذلك، القدرة على تحديد إينتيرنيورون موروث أو ذرياتهم الانقسامية بعد الإعراب عن Lhx6 عن طريق نظامنا مراسل المزدوج، يعزز بشكل كبير قدرة على توليد فروعه المتميزة وذرياتهم.

Protocol

ملاحظة: السطر ©جميع مراسل المزدوج الموصوفة في هذا البروتوكول متاح عند الطلب (sande@mail.med.upenn.edu). 1-إعداد وسائط الإعلام ملاحظة: الحارة جميع وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية قبل استخدامها في خلية ثقافة. وسائط تنتجها الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEF) (لإعدا…

Representative Results

البروتوكول، المذكورة في هذه الورقة هي نسخة معدلة من أعمالنا البروتوكولات المنشورة15،،من1617 وقد الأمثل للاستخدام مع خطنا مسك المزدوج-مراسل Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP. عن طريق إضافة مثبطات Wnt XAV 939 من DD0-5، جنبا إلى جنب مع إعادة الطلاء في …

Discussion

بينما يكون هذا الأسلوب فعالة للغاية في الزخرفة المستمدة من J1 ميسكس (سكرك-1010)، شهدنا نجاح متغير مع خطوط مسك ويعزل الاستنساخ الأخرى. على سبيل المثال، Foxg1::venus ميسكس (EB3 المشتقة؛ دانجو et al. 13) الاستجابة ضعيفة لهذا البروتوكول وتحريض Foxg1 من DD12 عادة ما يقارب 1-2%. للأسباب التي لا نفهم …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونحن ممتنون “شو تشينغ” على تطوير Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP مراسل المزدوج مسك خط فضلا عن تايسون جنيفر والتوقيع عاصف، وتروس تيم لعملهم في وقت مبكر في المساعدة على تطوير هذا البروتوكول. ونشكر أيضا ختم التدفق الخلوي الأساسية للمساعدة التقنية. أيد هذا العمل MH066912 R01 المعاهد الوطنية للصحة (SA) و F30 MH105045-02 (DT).

Materials

Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media — add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media — add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
  2. Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696 (2006).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature reviews. Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 14, 202-216 (2013).
  5. Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells. J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).
  6. Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: Linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
  7. Benes, F. M., Berretta, S. GABAergic interneurons: implications for understanding schizophrenia and bipolar disorder. Neuropsychopharmacology. 25, 1-27 (2001).
  8. Tyson, J. A., Goldberg, E. M., Maroof, A. M., Petros, T. P., Anderson, S. A. Duration of culture and Sonic Hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  9. Au, E., et al. A modular gain-of-function approach to generate cortical interneuron subtypes from ES cells. Neuron. 80, 1145-1158 (2013).
  10. Petros, T. J., Maurer, C. W., Anderson, S. A. Enhanced derivation of mouse ESC-derived cortical interneurons by expression of Nkx2.1. Stem Cell Res. 11, 647-656 (2013).
  11. Cambray, S., et al. Activin induces cortical interneuron identity and differentiation in embryonic stem cell-derived telencephalic neural precursors. Nat Commun. 3, 841 (2012).
  12. Chen, Y. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PloS one. 8, e61956 (2013).
  13. Danjo, T., et al. Subregional specification of embryonic stem cell-derived ventral telencephalic tissues by timed and combinatory treatment with extrinsic signals. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 1919-1933 (2011).
  14. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  15. Tyson, J. A., et al. Duration of culture and sonic hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  16. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  17. Tischfield, D. J., Kim, J., Anderson, S. A. Atypical PKC and Notch Inhibition Differentially Modulate Cortical Interneuron Subclass Fate from Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1135-1143 (2017).
  18. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 3078-3089 (2007).
  19. Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135, 1559-1567 (2008).
  20. Marin, O., Anderson, S. A., Rubenstein, J. L. Origin and molecular specification of striatal interneurons. Journal of Neuroscience. 20, 6063-6076 (2000).
  21. Xu, Q., Wonders, C. P., Anderson, S. A. Sonic hedgehog maintains the identity of cortical interneuron progenitors in the ventral telencephalon. Development. 132, 4987-4998 (2005).
  22. Glickstein, S. B., Alexander, S., Ross, M. E. Differences in cyclin D2 and D1 protein expression distinguish forebrain progenitor subsets. Cereb Cortex. 17, 632-642 (2007).
  23. Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13, 1090-1095 (2015).
  24. Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506, 16-29 (2008).
  25. Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314, 127-136 (2008).
  26. Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22, 820-827 (2012).
  27. Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 9682-9695 (2007).
  28. Fogarty, M., et al. Spatial genetic patterning of the embryonic neuroepithelium generates GABAergic interneuron diversity in the adult cortex. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 10935-10946 (2007).
  29. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
  30. Colasante, G., et al. Rapid Conversion of Fibroblasts into Functional Forebrain GABAergic Interneurons by Direct Genetic Reprogramming. Cell Stem Cell. 17, 719-734 (2015).
  31. Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 2612-2622 (2004).
  32. Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344, 1240622 (2014).
  33. Tyson, J. A., Anderson, S. A. GABAergic interneuron transplants to study development and treat disease. Trends Neurosci. 37, 169-177 (2014).
  34. Donegan, J. J., et al. Stem cell-derived interneuron transplants as a treatment for schizophrenia: preclinical validation in a rodent model. Mol Psychiatry. , (2016).
  35. Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nat Protoc. 11, 2223-2232 (2016).
  36. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  37. Wang, J., et al. Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression. Nat Protoc. 11, 327-346 (2016).
  38. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).
  39. Blahos, J., et al. A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors. J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).

Tags

Mouse Embryonic Stem CellsCortical Interneuron ProgenitorsNkx2.1ParvalbuminSomatostatinMEF Feeder CellsTrypsin-EDTAGelatin-coated PlatesKSR-N2 MediaEmbryoid Bodies

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image