Protocole en une étape pour l’évaluation du Mode de la radio-induite de cellules clonogéniques mort en microscopie par Fluorescence
Summary
Recherche sur les rayonnements ionisants (IR)-la mort des cellules clonogéniques induite est importante pour comprendre les effets de l’IR sur les tumeurs malignes et les tissus normaux. Nous décrivons ici un test en une seule étape pour évaluer les modes principaux de la mort cellulaire induite par l’IR clonogéniques basés sur la morphologie des 4′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)-teinté noyaux visualisées par microscopie à fluorescence.
Abstract
Recherche sur les rayonnements ionisants (IR)-la mort des cellules clonogéniques induite est importante pour comprendre l’effet de l’IR sur les tumeurs malignes et les tissus normaux. Nous décrivons ici une analyse rapide et efficace en une seule étape pour évaluer simultanément les modes principaux de clonogéniques la mort cellulaire induite par IR, c’est-à-dire, l’apoptose, catastrophe mitotique et sénescence cellulaire. Cette méthode, les cellules cultivées sur une lamelle couvre-objet sont irradiés aux rayons x et colorer avec 4′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). À l’aide de la microscopie en fluorescence, apoptose, catastrophe mitotique et sénescence cellulaire sont identifiées basées sur la morphologie caractéristique des noyaux colorés au DAPI. L’apoptose est déterminée par la présence de corps apoptotiques (c.-à-d., les noyaux condensés et fragmentées). La catastrophe mitotique est déterminée par la présence de noyaux qui présentent deux ou plusieurs lobes distincts et des micronoyaux. Sénescence cellulaire est déterminée par la présence de foyers hétérochromatiques associée à la sénescence (c.-à-d., ADN nucléaire contenant des foyers lumineux et denses de 30-50). Cette approche permet à l’expérimentateur de dépister facilement les modes de mort cellulaire clonogéniques à l’aide de diverses lignées cellulaires, les paramètres de traitement et/ou points dans le temps, dans le but d’élucider les mécanismes de l’apoptose dans les cellules cibles et conditions d’intérêt.
Introduction
Rayonnements ionisants (IR) induit des modes multiples de la mort des cellules clonogéniques. Recherche sur la mort cellulaire induite par l’IR clonogéniques est importante pour la compréhension de la toxicité de l’IR pour les tissus normaux, ainsi que pour développer des méthodes pour augmenter l’efficacité des traitements de radiothérapie du cancer. L’apoptose, catastrophe mitotique et sénescence cellulaire sont les principaux modes de clonogéniques la mort cellulaire induite par IR1. L’apoptose est un mode réglementé de mort cellulaire qui est initiée par des dommages d’ADN1. La catastrophe mitotique est mort cellulaire qui se produit en raison de la mitose anormale résultant non réparé de cassures double brin de l’ADN1. Sénescence cellulaire est définie comme un état de cellulaire irréversible croissance arrestation2; Notez que la sénescence cellulaire n’est pas la mort des cellules en soi, mais c’est un mode de la mort des cellules clonogéniques car il abolit la survie clonogénique de la cellule sénescente.
Diverses analyses cellulaires ont été développés pour évaluer individuellement l’apoptose, catastrophe mitotique et la sénescence cellulaire. L’apoptose peut être évaluée par terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-fin étiquetage (TUNEL) coloration annexin V coloration, dosages de fragmentation d’ADN et détermination de phase sub-G1 du cycle cellulaire par cytométrie de flux1. La catastrophe mitotique peut être évaluée par immunofluorescence souillant pour marqueurs mitotiques, dont MPM2 TUNEL coloration et microscopie électronique1. Sénescence cellulaire peut être évaluée par la coloration associés à la sénescence β-galactosidase (SA-β-Gal), essais d’arrêt de la croissance et microscopie électronique1. Ce qui est important, le mode prédominant de la mort des cellules clonogéniques diffère entre les lignées cellulaires et paramètres de traitement3,4. Par conséquent, afin d’élucider le profil global de la mort des cellules clonogéniques pour une variable donnée expérimentale, essais multiples couvrant l’ensemble de ces modes de décès doivent être menées ensemble, qui est du travail – et coûteux.
Dans cet article, nous décrivons un test rapide et efficace en une seule étape pour évaluer simultanément l’apoptose, catastrophe mitotique et la sénescence cellulaire induite par IR3,4. Cette méthode, les cellules cultivées sur une lamelle couvre-objet sont irradiés aux rayons x et colorer avec 4′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). À l’aide de la microscopie en fluorescence, apoptose, catastrophe mitotique et sénescence cellulaire sont tous identifiés basés sur les morphologies caractéristiques respectives des noyaux colorés au DAPI. Cette approche sera utile pour les applications, y compris le dépistage pour les profils de mort de cellules clonogéniques dans diverses lignées cellulaires, les paramètres de traitement et points dans le temps, dans le but d’étudier les mécanismes de mort cellulaire dans les cellules cibles et les conditions de intérêt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voici les étapes essentielles au sein du protocole. Tout d’abord, les cellules doivent être cultivées sur le plat de la culture comme une monocouche parce qu’une évaluation morphologique des noyaux colorés au DAPI est difficile pour les cellules multicouches. À cette fin, à l’étape 2.9, transfert minutieuse de la boîte de Petri à un incubateur est recommandée ; agitation de la boîte de Petri génère un tourbillon de cellules suspendus qui mène à la concentration de cellules au centre de la boîte de Pétri. En outre, overconfluence menant aux cellules multicouches doit être évitée. À cette fin, à l’étape 2.7, le nombre de cellules ensemencées sur la boîte de Petri est modifiable basée sur la population doubler le temps et l’intervalle entre l’irradiation et la fixation. Une confluence d’environ 80 au moment de la fixation est recommandée. Deuxièmement, la vitesse est important dans la fixation et coloration DAPI (c.-à-d., les étapes 4 et 5). Incohérence entre l’échantillon en ce qui concerne le temps pris par ces étapes peut conduire à l’hétérogénéité intensité du signal dans les noyaux, qui masquerait l’évaluation morphologique DAPI.
À l’étape 2.2, le nombre de lamelles dans un plat unique de la culture peut être augmenté ; un maximum de quatre lamelles peut être placé dans un plat de 35 mm, et le nombre peut être encore augmenté en utilisant de plus grands plats. Placer plusieurs lamelles dans chaque boîte de Pétri, permet le fonctionnement efficace d’évaluation de cours du temps pour un traitement donné (par exemple, la couverture feuillets peuvent être prélevés sur une boîte de Petri successivement à plusieurs moments d’intérêt).
À l’étape 3.2, la dose d’irradiation peut être modifiée selon l’intérêt des chercheurs. L’application d’une dose conforme à plusieurs lignées cellulaires permet la comparaison de la sensibilité de chaque mode de mort cellulaire clonogénique parmi les lignées de cellules. En revanche, l’utilisation de doses de survie iso-clonogéniques pour chaque lignée cellulaire permet la comparaison des profils de mort de cellules clonogéniques parmi les lignées de cellules. La dose de survie iso-clonogéniques peut être déterminée par le clonogéniques survival test12. La valeur de D10 , la dose qui fournit 10 % clonogénique de survie, est un critère d’évaluation commun pour la dose de survie iso-clonogéniques.
À l’étape 3.3, le temps d’irradiation de fixation peuvent être modifié selon l’intérêt des chercheurs ; Ceci est important car l’heure de pointe pour la sénescence cellulaire, l’apoptose induite par l’IR et catastrophe mitotique varie selon le traitement et la lignée cellulaire. Dans cet article, nous avons utilisé 72 h après l’irradiation comme le point de temps qui serait plus utile pour la présélection de profils de mort cellulaire clonogénique, basé sur plusieurs études de notre groupe et d’autres ont décrit comme suit1,2, 3 , 4 , 8 , 9: (i) X-ray induite par l’apoptose dans les cellules établies à partir des tumeurs solides pour la plupart survient quelques jours après l’irradiation. (ii) X-ray induite par la catastrophe mitotique dans les cellules cancéreuses se produit surtout à la deuxième ou la troisième mitose après la sortie de l’arrestation temporaire cycle cellulaire induite par l’irradiation. La libération produit habituellement environ 24 h après l’irradiation, suivie par mitoses répétées à des intervalles d’environ 24 h. (iii) X-ray – induit la sénescence cellulaire devient évidente après un intervalle dépend de la lignée cellulaire en cause : 2 jours après irradiation pour certains cas précoces et 7 jours après irradiation pour la plupart des lignées de cellules. Après avoir obtenu une vue d’ensemble de la cellule clonogéniques profils de mort de la présélection, le temps des expériences de cours fournira une élucidation plus détaillée de l’heure de pointe pour chaque mode de mort des cellules clonogéniques dans la lignée de cellules spécifiques et/ou de la condition de intérêt4.
Il est à noter que le DAPI test et le test de survie clonogénique de coloration, une méthode de l’étalon-or pour évaluation de rayonnement de sensibilité, ne sont pas interchangeables. Apoptose et catastrophe mitotique seulement durent des heures. Ainsi, le DAPI dosage pour un moment donné une coloration détecte l’apoptose et catastrophe mitotique qui se produit au moment de l’évaluation. En revanche, les résultats de la survie clonogénique de dosage à un moment donné point comprennent le montant total de l’apoptose et catastrophe mitotique qui avait eu lieu au cours de la période d’incubation généralement 10-14 jours après l’irradiation. Différent d’apoptose et catastrophe mitotique, cellules sénescentes restent sur la boîte de Petri ; ils s’accumulent graduellement au fil du temps après l’irradiation. Par conséquent, les résultats des deux le DAPI souillant le test et le test de survie clonogéniques reflètent le montant total de la sénescence qui ont eu lieu au cours de la période d’incubation. Ce qui est important, la proportion de l’apoptose, catastrophe mitotique et sénescence induite par l’irradiation varie considérablement selon la cellule de dose d’irradiation et de la ligne. Pris ensemble, théoriquement, les résultats d’un test ne peuvent être traduits directement dans ceux de l’autre essai.
Le DAPI test de coloration a quelques limitations. Tout d’abord, il reste controversé si catastrophe mitotique est un mode distinct de la mort cellulaire. Dans le domaine de la radiobiologie, catastrophe mitotique est considéré comme un mode majeur de mort cellulaire induite par l’IR qui se distingue des autres mécanismes de mort des cellules clonogéniques1. En revanche, d’autres soutiennent que cette catastrophe mitotique n’est pas un mode distinct de la mort cellulaire, mais plutôt un processus qui précède la mort des cellules dont l’apoptose et nécrose13,14. Ainsi, l’apoptose et catastrophe mitotique peuvent se chevauchent dans une certaine mesure. Deuxièmement, précédentes études suggèrent que la sénescence cellulaire peut se produire en l’absence de SAHF dans certaines lignées cellulaires et les paramètres de traitement2. À présents, d’autres dosages spécifiquement conçus pour chaque cellules clonogéniques mode de mort doit être utilisé pour augmenter la robustesse des conclusions d’une expérience donnée. Troisièmement, le DAPI souillant le dosage ne peut évaluer les modes de la mort des cellules clonogéniques que l’apoptose, catastrophe mitotique et sénescence cellulaire (p. ex., une nécrose et autophagie). Quatrièmement, l’utilité du DAPI souillant dosage comme un facteur prédictif de la réponse tumorale à la radiothérapie n’a pas été élucidée dans la clinique. De ce point de vue, l’analyse de survie clonogéniques, qui évalue le montant total de la mort des cellules clonogéniques, est supérieure à la DAPI test de coloration car une corrélation a été établie entre SF2, la fraction survivante des cellules irradiées à 2 Gy Rayons x et la réponse de la tumeur à15de la radiothérapie. Néanmoins, il convient de noter que le test de survie clonogéniques n’est pas utilisé largement dans la clinique, principalement en raison de l’exigence d’un degré élevé d’expertise et une longue période de temps (c’est-à-dire14 jours) pour l’acquisition de données. Par comparaison, la procédure pour le DAPI test de coloration est plus simple et prend beaucoup moins de temps, environ 3-4 jours, pour générer des résultats. L’utilité de la souillure de DAPIessai comme un facteur prédictif de la réponse tumorale à la radiothérapie sera testé dans la clinique dans un proche avenir.
En résumé, le DAPI souillant le dosage est un dosage de rentable en une seule étape à évaluer simultanément les trois modes principaux de mort cellulaire induite par l’IR clonogéniques. Cette approche permet de dépister facilement les modes de la mort des cellules clonogéniques pour diverses lignées cellulaires, les paramètres de traitement et points dans le temps, dans le but d’élucider les mécanismes de l’apoptose dans les cellules cibles et conditions d’intérêt.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Mme Akiko Shibata pour l’assistance technique. Ce travail a été soutenu par subventions depuis le ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science et technologie du Japon pour les programmes pour Leading Graduate Schools, cultivant des Leaders mondiaux en Heavy Ion Therapeutics et en génie.
Materials
| cover slip | Matsunami | C013001 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-250G | |
| phosphate-buffered saline | Cosmo Bio | 16232000 | |
| scalpel | Kai Medical | No.20, 520-A | |
| 35 mm cell culture dish | Falcon | 353001 | |
| trypsin | Wako | 201-16945 | |
| inverted phase microscope | Shimazu | 114-909 | |
| X-ray irradiator | Faxitron Bioptics | Faxitron RX-650 | |
| square culture dish | Corning | 431110 | |
| slide glass | Matsunami | Pro-11 | |
| DAPI staining reagent | Cell Signaling | 8961S | |
| fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| fluorescence microscope DAPI filter | Nikon | U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410 | |
| fluorescence microscope lens (20×) | Nikon | Plan Apo λ 20X/0.75 | |
| fluorescence microscope lens (60×, oil) | Nikon | Plan Apo λ 60X/1.40 oil | |
| oil | Olympus | N5218600 | |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi2 | |
| digital image acquisition software | Nikon | NIS-Elements Document | |
| lens cleaner | Olympus | OT0552 | |
| chloroform | Wako | 035-02616 |
References
- Wouters, B. G., Joiner, M. C., van der Kogel, A. J. Cell death after irradiation: how, when and why cells die. Basic Clinical Radiobiology. 4th ed. , 27-40 (2009).
- Aird, K. M., Zhang, R. Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). Methods Mol. Biol. 965, 185-196 (2013).
- Kobayashi, D., et al. Mitotic catastrophe is a putative mechanism underlying the weak correlation between sensitivity to carbon ions and cisplatin. Sci. Rep. 7, 40588 (2017).
- Amornwichet, N., et al. Carbon-ion beam irradiation kills X-ray-resistant p53-null cancer cells by inducing mitotic catastrophe. PLoS One. , 115121 (2014).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2, 2276-2284 (2007).
- Sawai, Y., et al. Effectiveness of sulforaphane as a radiosensitizer for murine osteosarcoma cells. Oncol. Rep. 29, 941-945 (2013).
- Cummings, B. S., Wills, L. P., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Curr. Protoc. Pharmacol. , (2012).
- Oike, T., et al. C646, a selective small molecule inhibitor of histone acetyltransferase p300, radiosensitizes lung cancer cells by enhancing mitotic catastrophe. Radiother. Oncol. 111, 222-227 (2014).
- Oike, T., et al. A synthetic lethality-based strategy to treat cancers harboring a genetic deficiency in the chromatin remodeling factor BRG1. Cancer Res. 73, 5508-5518 (2013).
- Russo, A. L., et al. In vitro and in vivo radiosensitization of glioblastoma cells by the poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor E7016. Clin. Cancer Res. 15, 607-612 (2009).
- Di Micco, R., et al. Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer. Nat. Cell Biol. 13, 292-302 (2011).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1, 2315-2319 (2006).
- Vakifahmetoglu, H., Olsson, M., Zhivotovsky, B. Death through a tragedy: mitotic catastrophe. Cell Death Differ. 15, 1153-1162 (2008).
- Imreh, G., Norberg, H. V., Imreh, S., Zhivotovsky, B. Chromosomal breaks during mitotic catastrophe trigger γH2AX-ATM-p53-mediated apoptosis. J. Cell Sci. 129, 1950 (2016).
- Torres-Roca, J. F. A molecular assay of tumor radiosensitivity: a roadmap towards biology-based personalized radiation therapy. Per. Med. 9, 547-557 (2012).
