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암 연구학

MicroRNA biopsia liquida di base: L'esperienza del Plasma quieto firma classificatore (MSC) per lo Screening del cancro del polmone

Published: October 26, 2017
doi:
10.3791/56326
, , , , , , , ,
1Department of Experimental Oncology and Molecular Medicine,Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, 2Unit of Thoracic Surgery,Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori

Summary

Qui, presentiamo il protocollo dettagliato adottato nel BioMILD screening trial per eseguire il test di classificatore di firma microRNA circolanti per la diagnosi precoce del cancro del polmone.

Abstract

Lo sviluppo di un test come minimo dilagante, come biopsia liquida, per la diagnosi precoce del cancro del polmone nella sua fase preclinica è cruciale per migliorare il risultato di questa malattia mortale. I microRNA (Mirna) sono specific, piccolo, regolazione dell’espressione genica, che può agire come messaggeri extracellulari di segnali biologici di RNA non codificanti derivati da cross-talk fra il tumore ed il suo microambiente circostante del tessuto. Così potrebbero rappresentare i candidati ideali per la diagnosi precoce del cancro del polmone. In questo lavoro, un flusso di lavoro metodologico per la validazione prospettica di un test di miRNA circolanti utilizzando carte personalizzato fatto microfluidica e PCR quantitativa in tempo reale in campioni di plasma di volontari arruolati nello screening trial del tumore del polmone è proposto. Inoltre, poiché il rilascio di Mirna correlate a emolisi e più generali problemi tecnici può influenzare l’analisi, la procedura di controllo di qualità inclusa le procedure operative standard inoltre è presentata. Il protocollo è riproducibile e dà risultati quantitativi affidabili; Tuttavia, quando si utilizzano grandi serie cliniche, sia pre-analitiche e analitiche caratteristiche dovrebbero essere valutate con cautela.

Introduction

Il cancro del polmone è il più comunemente diagnosticato cancro in tutto il mondo, rappresenta circa il 25% di tutte le diagnosi di cancro1. Nonostante la costante riduzione nel tasso di mortalità del cancro polmonare negli ultimi 2 decenni, principalmente a causa di uso del tabacco ridotta, cancro del polmone rimane la principale causa di morte per cancro negli uomini e nelle donne. Nel 2017, si prevede per tenere conto di circa il 25% e il 20% delle morti totali del cancro negli Stati Uniti e in Europa, rispettivamente1,2.

Poiché i sintomi non si verificano solitamente nella malattia precoce, la maggior parte dei cancri polmonari è diagnosticata nelle fasi tarda. Ciò conduce ad una limitata possibilità di intervento terapeutico e scarsa efficacia dei trattamenti per3. Di conseguenza, molti sforzi scientifici sono volti ad identificare un test efficace per la diagnosi precoce del cancro del polmone.

Una varietà di prove di screening Mostra che la radiografia del torace non ha alcun valore nello screening del cancro del polmone, mentre basse dosi computato tomografia (LDCT) è uno strumento migliore rispetto alla radiografia per la rilevazione precoce fase del polmone cancro4. Inoltre, è stato indicato thatscreening con l’uso di LDCT ridotta mortalità del cancro polmonare fino al 20% tra attuali ed ex fumatori pesanti5. Questi dati sostengono l’uso di screening del cancro polmonare in una popolazione ad alto rischio come definito nelle linee guida di diverse società professionali4,6.

Di nota, tra le preoccupazioni principali di screening LDCT, c’è l’alto tasso di risultati falsi-positivi e sovra-diagnosi. Che essendo così, la comunità scientifica sta cercando una strategia superare questi problemi e aumentare la specificità del test di screening LDCT. Lo sviluppo di biomarcatori complementari non invasivo potrebbe essere utile qui. Ad oggi, c’è un ampio elenco di biomarcatori candidato sotto inchiesta, come Mirna, DNA libero, metilazione del gene, piccole proteine ed altri7.

Biomarcatori basati su sangue, tra cui la risposta immunitaria biomarcatori e circolanti Mirna, sono quelli che hanno raggiunto il più avanzato convalida fase8. I biomarcatori di risposta immunitaria sono basati sulla conoscenza che le risposte immunitarie contro entrambi gli antigeni intracellulari e superficie del tumore sono accumulate nel polmone cancro pazienti9. Per esempio, Ajona et al. valutato il ruolo di C4d, un prodotto di degradazione della via classica del complemento, nella diagnosi e nella prognosi di polmone cancro10. In caso contrario, un siero di autoanticorpi disponibili in commercio test esame sette antigeni tumore-relativa è stata convalidata in malati di cancro del polmone non a piccole cellule e ha mostrato il 36% di sensibilità e 91% di specificità11. Risposta immunitaria biomarcatori sono interessanti, ma sono necessari ulteriori studi di convalida per una potenziale applicazione clinica.

i miRNA sono endogeni piccolo non-codificazione RNAs con un meccanismo conservato e grande significato funzionale in tutto i regni animale e vegetale. Il ruolo dei miRNA è di regolare la traduzione della proteina: reprimono l’espressione di un grande insieme di destinazione geni12. È stato ben documentato che espressione di alterazioni ofmiRNAs contribuisce alla patogenesi di più l’essere umano cancro12,13,14. Inoltre, entrambi tumore e cellule stromali rilasciano Mirna, stabilizzati per loro incorporazione in microvescicole o tramite associazione di proteine RNA-leganti, in fluidi corporei come plasma e siero15,16, urina17 e saliva18. Mirna di circolazione così può riflettere la risposta dell’ospite e l’interazione dinamica fra il tumore ed il suo microambiente19. Nel loro insieme queste osservazioni hanno fatto Mirna circolanti una promettente classe di biomarcatori per la rilevazione di cancro umano.

Mirna di circolazione può essere rilevata utilizzando diversi metodi: microarray Piattaforme20, quantitativa inversa trascrizione PCR (RT-qPCR)21e di prossima generazione sequenziamento (NGS)14,22. Vari studi di profilo di espressione basati sulle tecnologie di cui sopra sono stati sviluppati negli ultimi anni. Microarray è una tecnologia di alto-rendimento, in grado di analizzare fino a migliaia di Mirna in una sola analisi. Tuttavia, ha bassa gamma dinamica e la specificità rispetto a RT-qPCR o NGS. Inoltre, microarray è un metodo non quantitativi, quindi non occorre ulteriore validazione sperimentale. Metodi basati sulla sequenza possono permettere l’identificazione di Mirna sconosciuti e sono adatti soprattutto in una fase di scoperta. D’altra parte, NGS metodi sono ancora costose e richiedono attrezzature speciali ed esperti bioinformatici, limitando così il loro uso nelle coorti di convalida grande e nelle regolazioni cliniche23. Al momento, RT-qPCR è la piattaforma più adottata per la rilevazione di miRNA in un contesto clinico/diagnostica24in circolazione. Ci sono diverse tecnologie di RT-qPCR disponibili per l’analisi di Mirna, ma il gambo-ciclo RT seguita da TaqMan PCR è l’ più ampiamente usato25. Questa tecnica è estremamente sensibile e accurato (singola discriminazione del nucleotide) e ha un’alta gamma dinamica; Tuttavia, permette la rilevazione di Mirna conosciuti solo.

Il controllo di qualità di microRNA Studio (studio miRQC) di Mestdagh et al estesamente studiato le caratteristiche di alcune piattaforme disponibili in commercio per il Mirna profiling basato sui suddetti tre tecnologie26. Analizzando 196 miRNA nei tessuti e nei campioni di siero, le prestazioni delle diverse piattaforme è stata valutata in termini di riproducibilità, sensibilità, precisione, specificità e concordanza di espressione differenziale. I risultati hanno mostrato che piattaforme basate su NGS e tecnologie di microarray ha avuto una più alta riproducibilità e specificità, ma RT-qPCR piattaforme erano più accurata, sensibile e ha avuto un più alto tasso di rilevamento, soprattutto per il basso inpui campioni di RNA, come corpo fluidi. RT-qPCR sembra così essere il metodo più adatto per una potenziale applicazione nella diagnostica clinica della routine.

Nel 2011, Sozzi et al ha analizzato il profilo di miRNA di campioni di plasma raccolti da volontari iscritti ad un primo LDCT screeningtrial (prova INT-IEO)27 e quattro firme di miRNA composte dai rapporti reciproci tra 24 circolanti Mirna sono stati generati. Queste firme sono stati in grado di discriminare individui liberi malattia da pazienti con qualsiasi o letale cancro polmonare al tempi o fino a 2 anni prima LDCT malattia rilevamento28. In un ulteriore documento, lo stesso gruppo descritto per la prima volta il classificatore di firma di miRNA (MSC), ottenuto combinando le quattro firme di miRNA per stratificare i pazienti in tre livelli di rischio: alto, intermedio e basso. Sua utilità clinica è stata convalidata in un grande insieme retrospettivo di più di 1.000 individui arruolati nello studio screening mite, uno studio randomizzato di confronto tra le braccia LDCT annuale o biennale con un braccio di osservazione29. Infatti, la combinazione di MSC e LDCT ha ridotto il tasso di falsi positivi LDCT di circa 5 volte e sono stati i tre gruppi di rischio MSCassociati con la sopravvivenza globale.

Più tardi, nel 2013 presso la “Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori” (Milano, IT) uno prospettico screening trial (BioMILD) implementazione LDCT con il plasma base test di MSC è stato lanciato. I volontari arruolati nello studio BioMILD subiscono ritiro LDCT e sangue che viene immediatamente elaborato per separare il plasma per miRNA profilatura mediante carte personalizzato fatto microfluidica. La combinazione dei risultati LDCT e MSC definisce lo specifico algoritmo24di screening.

Nel presente lavoro, l’intero protocollo metodologico utilizzato nella prova BioMILD è descritto, a partire dalla raccolta del campione di sangue, all’isolamento del plasma, estrazione di RNA, e l’espressione di 24 Mirna profilatura mediante personalizzato fatto RT-qPCR microfluidic cards. Data l’elevata costanza e riproducibilità, queste procedure possono essere utilizzate anche per lo sviluppo delle biopsie liquide base di miRNA in altre malattie.

Protocol

il protocollo è stato approvato dal comitato etico di ricerca della nostra istituzione. 1. raccolta di campioni di plasma raccogliere 10 mL di sangue intero campione in provette Vacutainer con verniciato a spruzzo K 2 EDTA e conservare a temperatura ambiente. Nota: Per ridurre al minimo l’emolisi, separare il plasma entro 2 h. Non conservare il sangue intero a bassa temperatura (cioè, 4 ° C) per evitare shock termici e celle di lisi che conducono ad un rilascio di miRNA aspecifici. Entro 1 h, separare il plasma di un primo passo di centrifugazione a 1.258 x g e a 4 ° C per 10 min. Trasferire il plasma surnatante in una provetta da 15 mL, evitando accuratamente il contatto con l’anello linfocitaria. Centrifuga il plasma una seconda volta a 1.258 x g e a 4 ° C per 10 min. Aliquot 1 mL di plasma in 1,5 mL cryovials, evitando la frazione del plasma alla base del tubo di raccolta. Conservare tutte le aliquote a − 80 ° C, tranne uno per la valutazione del hemolysis. L’analisi molecolare deve essere eseguita all’interno di 5 settimane. 2. Valutazione del Hemolysis mediante misura spettrofotometrica immediatamente dopo il passaggio di separazione del plasma, in una cuvetta per spettrofotometria, rendere un 01:10 diluizione del campione del plasma in 1X PBS (ad es., 100 µ l di plasma in 900 µ l di 1 X PBS) e mescolare per omogeneizzare it. Nota: Il campione di plasma non deve essere congelato prima le misure spettrofotometriche, come il congelamento-scongelamento del campione (e in particolare in campioni lipemici), potrebbero formare Floccula che interferiscono con l’analisi spettrofotometrica. Leggere l’assorbanza a 375 nm, 414 nm, 541 nm e 576 nm utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis, con una correzione della linea di base si stabilì a 750 nm e una lunghezza di percorso di 10 mm. eseguire una misurazione in bianco con 1 mL di PBS 1X. Calcolare il rapporto tra l’assorbanza a 414 nm e 375 nm; se superiore a 1.4, si consideri l’esempio emolizzato e ripetere il prelievo di sangue (QC1 nella tabella 1). 3. Estrazione di RNA totale del plasma preparare una soluzione di 1-Thioglycerol/omogeneizzazione (OMG) con 20 µ l di 1-Thioglycerol per mL di soluzione di omogeneizzazione. 1-Thioglycerol, essendo viscoso, Pipettare attentamente per una misurazione accurata. Raffreddare la soluzione di OMG in ghiaccio o a 2-10 ° C prima dell’uso it. Nota: La soluzione di lavoro è stabile a 2-10 ° C per 1 mese. Sospendere la dnasi liofilizzata ho aggiungendo 275 µ l della nucleasi-libero dell’acqua nel flaconcino e mescolare delicatamente (Centrifugare). Come un aiuto visivo, aggiungere 5 µ l di blu tingere alla ricostituita dnasi I e dispensare la soluzione in aliquote monouso in tubi di nucleasi-free. Memorizzare ricostituita dnasi I a-30 ° C a -10 ° C. a partire da 200 µ l di plasma, aggiungere 200 µ l della soluzione refrigerata OMG. Vortex 15-30 s per garantire una completa omogeneizzazione. In caso di schiumatura, lasciare il campione stabilirsi su Ice. Aggiungere 200 µ l di tampone di lisi e 25 µ l di proteinasi K per il campione omogeneizzato e vortexare per 20 s. Incubare i campioni per 15 min in un thermomixer preriscaldati a 37 ° C. Caricare una cartuccia per ogni campione sul vassoio mazzo dello strumento e inserire l’otturatore nella posizione corretta. Trasferire il lisato nella posizione appropriata nella cartuccia strumento. Aggiungere 5 µ l di dnasi I soluzione fino alla posizione corretta nella cartuccia. Aggiungere 60 µ l di acqua priva di nucleasi alla base di ogni provetta di eluizione. Seleziona il " RSC miRNA tessuto " metodo e iniziare la purificazione automatizzata eseguita. I campioni di RNA totali possono essere conservati a − 80 ° C. 4. Basato su Taq RT utilizzare la piscina di Primer Taq RT con i miRNA di interesse per convertire il RNA in cDNA con il Kit di trascrizione inversa di Taq MicroRNA. Preparare 12 µ l di miscela di reazione di RT sul ghiaccio in una microcentrifuga da 1,5 mL secondo le istruzioni del kit, utilizzando 6 µ l della piscina personalizzata del Primer Taq RT. Aggiungere 3 µ l di totale di RNA per un volume finale di 15 µ l e incubare in ghiaccio per 5 min. Caricare la reazione di RT su un termo-cycler configurato come segue: 16 ° C per 30 min, 42 ° C per 30 min, 85 ° C per 5 min e permanenza a 4 ° C. Nota: Il cDNA possa essere conservare a -15 a-20 ° C per almeno una settimana. 5. Pre-amplificazione Mix 2,5 µ l di ciascun prodotto di RT con 12,5 µ l della Taq Master Mix 2x e 3,75 µ l Taq Custom piscina acqua 6,25 priva di nucleasi µ l, per un volume totale di 25 µ l. Eseguire la reazione di pre-amplificazione utilizzando un termo-cycler secondo il seguente profilo termico: 95 ° C per 10 min, 55 ° C per 2 min, 72 ° C per 2 min, 12 cicli di 95 ° C per 15 s e 60 ° C per 4 min , quindi tenere a 99,9 ° C per 10 min e a 4 ° C. Diluire il prodotto con l’aggiunta di 175 µ l di 0.1 X TE, pH 8.0. Nota: Il prodotto diluito può essere deposito a -15 a-20 ° C per almeno una settimana. 6. Reazione di RT-qPCR su Custom Taq matrice MicroRNA carte uso il microfluidicCustom 384 pozzetti Taq matrice MicroRNA carta per misurare i livelli del plasma di miRNA specifici 24 (notati in duplice copia) su 8 campioni contemporaneamente. MiRBase ID (v21) per i 24 miRNA sono: ha-miR-101-3 p, ha-miR-106a – 5p, ha-miR-126-3 p, p ha-miR-133a – 3P, ha-miR-140-3, ha-miR-140-5 p, ha-miR-142-3 p, ha-miR-145-5 p, ha-miR-148b – 3P, ha-miR-15b – 5p, ha-miR-16-5 p, p ha-miR-17-5, ha-miR-197-3 p, p ha-miR-19b – 3P, ha-miR-21-5, ha-miR-221-3 p, ha-miR-28-3 p, ha-miR-30b – 5p, ha-miR – 30C – 5p, ha-miR-320a, ha-miR-451a, ha-miR-486-5 p, ha-miR-660-5 p e ha-miR-92a – 3 p. Mix 1.13 µ l del campione diluito PreAmp con 56,25 µ l di 2 X Taq Universal Master Mix e 55.69 µ l di acqua priva di nucleasi in un tubo di 0,5 mL. Caricare fino a 8 miscela di reazione PCR sulle carte di MicroRNA Custom Taq Array. Centrifugare a 311 x g per 2 min. Guarnizione la carta personalizzata con il sigillante di scheda matrice. Eseguire il tempo reale reazione usando un sistema di PCR Real-Time modificando i parametri in bicicletta come seguito: 94,5 ° C per 10 min, 40 cicli di 97 ° C per 30 s e 59,7 ° C per 60 s. 7. Estrapolazione di dati e generazione di rapporti uso il software per ottenere i valori Ct crudi, impostando un’automatica linea di base per rimuovere i segnali di sfondo e una soglia fissa di 0,15 per i saggi e i campioni. Rimuovere le macchie con curve di amplificazione poveri e/o segnali di riferimento passivo poveri. Esportare valori di Ct non elaborati in ". xls " formattare e utilizzare il valore Ct dire dei due duplicati per ulteriori analisi. Correlare Mirna ' livelli di espressione di storiche misure su campioni di studio clinico (Tabella 2). Se almeno il 50% dei campioni su ogni carta personalizzato fatto microfluidici provocare un Pearson ' correlazione s < 97.5, ripetere la carta (QC2 nella tabella 1). Calcola il − ΔCts tra tutti i miRNA, equivalenti ai valori dei rapporti miRNA log2. 8. Valutazione del Hemolysis di quieto correlato firma genera la firma di miRNA correlate a emolisi utilizzando i seguenti rapporti di miRNA con rispettivi cut-off (valori log2) per campioni di plasma di immagazzinaggio corto (1-5 settimane al − 80 ° C): miR-126/451 < − 0,07, 15b/451 < − 3,67, 221/451 < − 3.18, 30b/451 < − 1.1, 126/486-5p < − 0,33, 15b/486-5 p < − 3,86, 221/486-5 p < − 3,17, 30b/486-5 p < − 1.42, 126/92a < 1.8, 15b/92a < − 1.8, 221/92a < − 1,04, 30b/92a < 0,87, 126/16 < − 2,85, 15b/16 < − 6,33, 221/16 < − 5.9, 30b/16 < − 3,68. Classificare come campioni emolizzati, dove almeno il 50% dei rapporti (8 su 16) superare i rispettivi cut-off (QC3 nella tabella 1). 9. Definizione del livello di rischio: alto, intermedio e basso definire le quattro firme di miRNA rapporti che compongono la MSC come riportato nella Figura 3: rischio di malattia (RD), rischio di malattia aggressiva (RAD), presenza di malattia (PD) e la presenza di malattia aggressiva (PAD). Per ogni firma, definire i rapporti che superano il valore di cut-off rispettivi per campioni di plasma di immagazzinaggio corto (1-5 settimane al − 80 ° C). Il numero di rapporti superiore al necessario per essere considerato positivo è 9 su 27 per RD e PD e 14 su 28 per RAD e PAD ( Figura 3 A). Attribuire a ciascun campione il rispettivo livello di rischio MSC come segue: a basso rischio se RD neg ∩ PD neg ∩ RAD neg ∩ PAD neg; rischio intermedio se RD pos ∪ PD pos ∩ RAD neg ∩ PAD neg; o ad alto rischio se RAD pos ∪ PAD pos ( Figura 3 B).

Representative Results

La prova di BioMILD è uno studio prospettico per la diagnosi precoce del cancro polmonare con lo scopo di verificare l’efficienza di un approccio combinato di LDCT-MSC come test di screening di prima linea in un’ampia coorte di individui fumatore pesante. Una classe di rischio è attribuita a ciascun volontario sulla base del test di miRNA, che valuta i rapporti tra 24 al plasma circolanti Mirna. Come in gran parte segnalati30,31,32, il hemolysis è un problema critico per l’analisi di miRNA, di circolazione, poiché risultati falsi potrebbero essere ottenuti a causa di un rilascio non specifico di Mirna dalle cellule del sangue. Del flusso di lavoro metodologico proposto, un controllo di qualità pre-analitico passaggio (QC1 nella tabella 1) per identificare emolizzati e quindi non analizzabile, campioni di plasma è stata descritta. Figura 1 riporta un’analisi spettrofotometrica dei emolizzati (Figura 1A) e non emolizzato (Figura 1B) campioni di plasma con rispettivi A414/A375 valori. In un contesto clinico erano il risultato di un test molecolare è cruciale per la gestione dei volontari, permette questo QC1 ripetendo il prelievo di sangue e, nella maggior parte dei casi, ripristinando il campione. Dopo la trasformazione molecolare, le prestazioni di RT-qPCR dovrebbero essere valutate con precisione per identificare eventuali problemi tecnici. Figura 2 A Mostra un RT-qPCR con prestazioni basse a causa di un segnale di riferimento passivo poveri. In questo caso ricaricare il prodotto pre-amplificazione di una nuova carta di microfluidica è raccomandato. Quando il RT-qPCR si comporta bene, come in Figura 2B, la carta procede al primo post controllo qualità analitico passo per garantire che i valori di espressione di miRNA sono comparabili con la misura storica (QC2 nella tabella 1). Se il passaggio di QC2 non riesce, potrebbe essersi verificato un problema tecnico durante la trascrizione inversa o nelle reazioni di pre-amplificazione, e conviene ripetere l’intera elaborazione molecolare a partire da trascrizione inversa. L’ultimo passaggio di controllo di qualità (QC3 nella tabella 1) valuta l’emolisi anche a livello molecolare. I livelli di espressione dei 4 dell’eritrocito specifici Mirna (mir-16, mir-451, mir-486-5 p e mir-92a) sono stati confrontati a quelli di 4 non-emolisi correlati Mirna (mir-126, mir-15b, mir-221 e mir-30b), generare la firma di miRNA correlate a emolisi composto dalla 16 (4×4) rapporti di miRNA. Campioni positivi sono classificati come emolizzati, mentre campioni negativi proseguono per la classificazione del livello di rischio MSC finale come descritto nel protocollo sezione 9 e Figura 3. Figura 1: Analisi spettrofotometrica dei campioni di plasma fresco. Spettrofotometrici profili di (A), 2 campioni emolizzati e campioni di plasma di non emolizzato 2 (B), misura del rapporto di assorbanza tra lunghezze d’onda A414 e A375. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2 : RT-qPCR prestazioni a microfluidic cards analisi. Amplificazione e multicomponenti terreni poveri di confronto (A) e (B) buona qualità schede di microfluidica. Tutti i 24 Mirna e un singolo miRNA esemplificativi sono segnalati in ogni pannello. Le trame multicomponente illustrano i segnali di riferimento passiva che si verificano in queste reazioni di RT-qPCR. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Algoritmo per la stratificazione del rischio di MSC. Risultati rappresentativi considerando 6 campioni di plasma da volontari iscritti BioMILD screening trial. (A) le firme dei miRNA-rapporti di rischio di malattia (RD), rischio di malattia aggressiva (RAD), presenza di malattia (PD), presenza di malattia aggressiva (PAD) e corrispondenti valori di cut-off (log2) per campioni di plasma conservati a-80 ° C per a almeno 1 settimana e fino a 5 settimane. (B) combinazione delle quattro firme per stratificare i campioni analizzabili in alta (H), intermedio (I) e MSC (L) basso livello di rischio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Insidie e sfide del flusso di lavoro metodologico
Come BioMILD è il primo studio prospettico analizzando Mirna circolanti come strumento diagnostico, soglie e cut-off utilizzato per l’analisi dei dati sono stati generati da serie retrospettiva. Al fine di superare il problema dell’intervallo di archiviazione diversi di campioni di plasma, i parametri possono essere raffinati possibilmente ottenere un aumento delle prestazioni MSC. Tuttavia, prima di iniziare l’analisi di Mirna, diversi aspetti del processo complessivo devono essere valutati con attenzione, come ad esempio i criteri di inclusione, la raccolta dei campioni ed elaborazione, e l’algoritmo di bioinformatica ha adottato per l’analisi dei dati. Nelle sezioni seguenti si concentreranno sui punti più critici del flusso di lavoro descritto nel presente documento, affrontando le questioni più importanti di ogni singolo passo e poi proporre strategie per superarli.

Popolazione dello studio
I criteri di iscrizione per il BioMILD screening trial sono: 50-75 anni vecchi, pesanti fumatori attuali o ex (meno di 10 anni) con almeno 30 anni di pacchetti e senza precedenti di cancro entro 5 anni. In questa popolazione, la prevalenza del cancro del polmone stimato e l’incidenza all’anno erano circa l’1% e dello 0,7%, rispettivamente. Al fine di applicare il test MSC come descritto nel protocollo proposto, la popolazione analizzata dovrebbe mantenere caratteristiche simili. In particolare, il passo di QC2 sopra descritto comporta confronto con dati storici ottenuti da una popolazione equivalente. Mentre una correlazione sotto 97,5 potrebbe essere indicativa di problemi tecnici, d’altra parte, maggior parte dei individui con livelli miRNA alterata circolazione che riflette il rischio di avere il cancro al polmone sono in realtà sotto quella soglia. In altre parole, se il passo di QC2 con i parametri riportati qui è applicato ad una popolazione a rischio maggiore di sviluppare il cancro del polmone, può escludere campioni accettabili. Parametri di riferimento nuovi, corretto dovrebbero quindi essere definiti che sono specifici per ogni popolazione analizzata secondo i risultati attesi.

Emolisi e raccolta del sangue
La raccolta di campioni biologici è un passo cruciale pre-analitico, poiché può compromettere le caratteristiche e qualità del campione e quindi modificare i risultati finali dell’analisi. Per quanto riguarda i campioni di sangue, è importante raccogliere il sangue fresco e trattare il campione più rapidamente possibile. Campioni devono essere conservati a 4 ° C né congelati dopo ritiro di anima, poiché il congelamento e scongelamento passaggi può indurre la lisi cellulare (emolisi) e degradazione del RNA. Per ridurre al minimo il processo di emolisi, si consiglia di separare il plasma entro 2 h da sangue raccolta31 .

Il hemolysis è in gran parte a causa della rottura dei globuli rossi (RBC) e conseguente rilascio del loro contenuto nell’ambiente circostante. Questo potrebbe essere un problema per la circolazione di Mirna test perché rilascio del contenuto intracellulare di RBCs altera drammaticamente il profilo di microRNA nel sangue, potrebbero compromettere la precisione di analisi basata su plasma30.

Essere in grado di identificare anche i livelli minimi di emolisi in campioni di plasma è cruciale per gli studi basati sui miRNA come biomarcatori di circolazione. Emolisi possono inizialmente essere valutata mediante ispezione visiva, dal dopo le due fasi di centrifugazione, che il colore del plasma può variare dal giallo al rosso per campioni altamente emolizzati. Tuttavia, la semplice ispezione visiva non può essere abbastanza sensibile nel contesto della ricerca sui biomarcatori molecolari.

Un metodo semplice per identificare i campioni emolizzati del plasma pre-analitico è la misurazione spettrofotometrica alla lunghezza d’onda (λ) = 414 nm dell’assorbanza del picco principale ossiemoglobina, dopo adeguamento appropriato per qualsiasi altra fonte di interferenza. Per questo motivo, abbiamo normalizzato il 414 nm picco per il valore di assorbanza a 375 nm, indicativo del contenuto lipidico33. In alternativa, o meglio, in combinazione, un lipemia-independenthemolysis Punteggio ottenuto (HS) può essere usato34. Questa procedura di base di spettrofotometricamente può identificare almeno 6,1 mg/dL di emoglobina libera. In caso contrario, i campioni emolizzati possono essere identificati attraverso la rilevazione di miRNA specifici dell’eritrocito. Poiché anche una percentuale molto bassa di emolisi può suscitare un aumento considerevole dell’eritrocito specifici miRNA livelli32, Fortunato et al identificata una firma specifica correlate a emolisi basata su 16 Mirna-rapporti che possono in modo efficiente classificare il hemolysis in campioni di plasma33. Tutti i saggi citati possono essere utilizzati in combinazione dal rapporto di assorbanza 414/375 e/o il HS sono adottati in una fase pre-analitica, risparmio dei costi maggiori, mentre la misurazione correlate a emolisi Mirna possono essere utilizzati in una fase post-analitica come un controllo di qualità passo.

Mirna isolamento e purezza di RNA di circolazione
L’estrazione procedura di RNA è un passo molto influente per il successo delle analisi successive. A partire da un esempio di input basso, quali plasma, estrazione deve essere il più efficiente possibile garantire un’accurata quantificazione di Mirna. Plasma è caratterizzato da alte concentrazioni di molte proteine, comprese nucleasi e altri componenti che possono interferire con le reazioni enzimatiche a valle di RT-qPCR e potrebbero influenzare la rilevazione di Mirna in circolazione. Diversi metodi di estrazione sono stati utilizzati in questi tipi di studi, ma in generale, estrazione biologica seguita da arricchimento di RNA a base di silice permette la rimozione di inibitori del plasma meglio poi TRIzol solo35. Tuttavia, negli ultimi anni, estrazione manuale è stato sostituito da estrazione automatizzata. Il minore rischio di contaminazione, la riproducibilità superiore e l’uso di tempo economico sono i principali vantaggi dei sistemi automatizzati rispetto ai protocolli di isolamento manuale. Inoltre, metodi di estrazione automatizzata ha prodotto le quantità elevate di miRNA da campioni di sangue e la massima efficienza rispetto al manuale protocolli36.

Problema di normalizzazione
Normalizzazione dei livelli plasmatici di miRNA è ancora una questione controversa. Infatti, le differenze di quantità o qualità del campione possono interferire con l’identificazione dei veri cambiamenti nei livelli di espressione di Mirna causati dalla presenza o rischio di malattie e così che portano a interpretazioni di dati ambigui e fuorvianti conclusioni. Finora, la mancanza di consenso ha provocato varie strategie di normalizzazione37.

RNA totale Estratto da campioni di plasma è di solito inferiore alla soglia di metodi di quantificazione standard quali spettrofotometria UV o spettrofotometria di fluorescenza-basata, così precludendo RNA massa standardizzazione38. Di conseguenza, un volume fisso, piuttosto che una quantità fissa di RNA eluito dovrebbe essere scelto come input per la reazione di RT39.

Servizio pulizie trascrizioni utilizzate per l’analisi di miRNA nei campioni di tessuto, come RNU48 e RNU6, non sono adatti per normalizzare misure miRNA extracellulare, in cui entrambi non sono sempre rilevabili in circolazione, a causa di degradazione mediata da RNasi40, e sono anche deregolamentati in un modo specifico di malattia37. Non è chiaro se qualsiasi Mirna circolazione potrebbero essere usati efficacemente come riferimento a controlli. Ad esempio, miR-16 è frequentemente proposta per le pulizie, ma ddiversi studi hanno dimostrato che esso è liberalizzato in campioni di plasma di cancro pazienti28,37. Inoltre, livelli di miR-16 sono altamente interessati da emolisi30.

Mentre per le analisi di alto-rendimento misura diversi Mirna e normalizzare il valore di expression media è generalmente accettati41, quando un numero limitato di Mirna deve essere analizzato, questo approccio di normalizzazione non può essere applicato. Al fine di bypassare il problema di normalizzazione, Boeri et al precedentemente stabilito un algoritmo basato su rapporti reciproci tra 24 Mirna28. Tale approccio, pur essendo molto utile per lo sviluppo dello strumento di diagnostica, non consente facilmente distinguere efficacemente alterato Mirna che eventualmente, avere un ruolo nello sviluppo del tumore e identificando così Mirna come calibratori funzionanti. Un’altra strategia efficace, adottata dal gruppo di Bianchi et al. che sviluppato un siero miR-Test per la diagnosi precoce del cancro del polmone, si basava sulla normalizzazione sulla media geometrica di un gruppo di 6 “le pulizie del siero-Mirna” variando meno tra i campioni e classi di pazienti42.

Caratteristiche di base di miRNA biopsia liquida e potenziali applicazioni
Base di plasma MSC è un test non invasivo molecolare studiato per la diagnosi precoce del cancro polmonare in fumatori pesanti. Il test MSC può identificare i soggetti intermedi o ad alto rischio prima rilevazione del cancro del polmone di LDCT, con elevata sensibilità (SE, 87%) e valore predittivo negativo (NPV, 99%). In particolare, MSC potrebbe implementare lo screening LDCT riducendo i risultati falso-positivi al 3,7%, da 19,7% per LDCT da solo29. Il test MSC ha anche dimostrato di avere una buona prestazione prognostica quando si considera unico polmone malati di cancro e potrebbe essere utilizzato come strumento di monitoraggio, da solo o in combinazione con altri parametri clinici patologici43,44. Potenzialmente, il test MSC potrebbe consentire una maggiore coerenza delle procedure diagnostiche di cancro del polmone, diminuendo così lo screening rapporto costo-efficacia.

Oltre a MSC, sono stati segnalati altri test non-invasivi per la diagnosi precoce del cancro del polmone. Bianchi et al. proposto un circolazione miR-Test basato su un 34-miRNA firma45, poi ridotto a una firma di 13 miRNA42. Convalida e fordiscovery di campioni di siero sono stati ottenuti dalla continua osservazione di fumatori soggetti (Cosmo) LDCT screening trial, eseguito presso l’Istituto europeo di Oncologia (IEO, Milano, Italia). Il miR-Test ha mostrato 78% Precisione per rilevazione del cancro del polmone in volontari ad alto rischio. Tra i 13 siero-Mirna e 24 che compongono la MSC, solo 5 miRNA sono stati sovrapposti (miR-92a, miR-30b, miR – 30C, miR-148a e miR-140-5p). Questo potrebbe essere dovuto al diverso tipo di a partire campioni (siero vs plasma) e di elaborazione dei dati. Infatti, per la miR-prova, Mirna selezionati di 6 autori che si comportano come le pulizie in siero, 3 dei quali erano inclusi anche tra i rapporti di miRNA MSC (miR-15b, miR-19b e miR-197). Tuttavia, la MSC nel plasma e il miR-Test nei campioni di siero più profondamente convalidare l’uso di miRNA-based biopsia liquida per rilevazione del cancro del polmone.

Mirna profilatura per l’identificazione di biomarcatori del cancro del polmone sono stato effettuato anche su campioni di espettorato46. Espettorato può essere facilmente raccolto e i livelli di espressione di miRNA sembrano essere estremamente stabile in esso. Tuttavia, volontari di screening del cancro del polmone sono più vecchi di 50-55 anni e sono forti fumatori con co-morbidità come la BPCO, rendendo difficile ottenere l’espettorato. Infatti, tra i diversi liquidi corporei, plasma è una delle migliori alternative per studiare il ruolo potenziale dei miRNA come (ma non limitati a) biomarcatori del cancro del polmone.

Nel complesso, la procedura descritta nel presente documento può essere rilevante nel contesto di varie malattie, senza alcuna restrizione nel tipo della patologia studiata (da cancro, al sistema nervoso e disturbi cardiovascolari o diabete) e nello scopo di uso clinico (un biomarcatore per la diagnosi, prognosi o anche la risposta al trattamento).

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano Paola Suatoni, Elena Bertocchi, Carolina Ninni, Annamaria Calanca, e Chiara Banfi per gestione volontari negli studi e per l’assistenza amministrativa; e Claudio Jacomelli e Claudio Citterio per la gestione dei dati. Il lavoro è stato sostenuto dall’associazione italiana ricerca sul cancro [n. 15928 up, 14318 GS e 12162 le sovvenzioni (programma speciale “Strumenti innovativi per la diagnosi precoce e la valutazione del rischio di cancro”, 5 x 1000)]; Ministero della salute italiano [Grant No. RF-2010]; Grant CA166905 UO1, il National Cancer Institute (USA). MB è stato sostenuto da una borsa di studio Fondazione Pezcoller.

Materials

 1x PBS  Lonza BE-17-516
20xTE Buffer, pH 8.0 Molecular probe T11493 Dilute the 20X stock solution to have the final concentration of  0,1X in Nuclease-free water
Nuclease-free water 
Maxwell RSC miRNA Tissue Kit  Promega AS1460 The kit contains Homogenization Solution, DNase I, Proteinase K, Lysis Buffer and cartridges. For 1-Thioglycerol, inhalation and contact with skin and eyes should be avoided. Use it under a Fume Cabinet.
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit  Thermo Fisher 4366596
Custom TaqMan RT Primer Pool  Thermo Fisher 4459649
TaqMan PreAmp Master Mix 2X  Thermo Fisher 4391128
Custom TaqMan  PreAmp pool  Thermo Fisher 4459657
TaqMan Universal Master Mix II, No UNG 2x  Thermo Fisher 4440048
Custom TaqMan Array MicroRNA Cards  Thermo Fisher 4449137 Bring the Custom TaqMan Array MicroRNA Cards to room temperature before to load samples
Vacutainer Safety-Lock Blood Collection Set  Becton Dickinson 367286-364815
Vacutainer plastic spray-coated K2EDTA tube.  Becton Dickinson 366643 Lavender BD Hemogard closure 
Cuvette PS semi-micro  VWR/PBI  643-0326 Light path 10 mm
NanoDrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher
Cryogenic vials 1.5 ml  Sigma-Aldrich Z359033
Centrifuge 5810R  Eppendorf Bring the centrifuge to 4 °C before starting plasma collection
Heraeus Multifuge 3S+ Centrifuge Thermo Fisher D-37520
Vortex Mixer Velp Scientifica F202A0173
ThermoMixer T- shaker Euroclone  A00564 Bring the Thermo Mixer to 37 °C before starting RNA  extraction
Maxwell RSC Instrument Promega AS4500
GeneAmp PCR System 9700 thermo-cycler  Thermo Fisher
ViiA 7 Real-Time PCR System  Thermo Fisher
ViiA 7 RUO software  Thermo Fisher
Arrey Card Staker/Sealer Thermo Fisher 4331770
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Mensah, M., Borzi, C., Verri, C., Suatoni, P., Conte, D., Pastorino, U., Orazio, F., Sozzi, G., Boeri, M. MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening. J. Vis. Exp. (128), e56326, doi:10.3791/56326 (2017).
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