Biofilm oral toma de muestras para análisis de microbioma en niños sanos
Summary
Cambios en el microbioma oral a lo largo de la infancia son de creciente interés. Comparación de microbioma diferentes estudios revela una falta de protocolos de muestreo estandarizados. Espacio limitado hace muestreo del sonido surco subgingival de niños desafiantes. Papel punto de muestreo se presenta aquí en detalle como el método de elección para esta área.
Abstract
Biofilm oral y su análisis molecular proporcionan la base para la investigación varias investigaciones dentales y preguntas clínicas. Conocimiento de la composición de la biopelícula conduce a una mejor comprensión de los mecanismos cariogénicas y periopathogenic. Cambios microbianos tienen lugar en la cavidad oral durante la infancia son de interés por varias razones. La evolución de la microbiota oral del niño y los cambios en su composición deben analizarse más para entender y posiblemente prevenir la aparición de la enfermedad. Al mismo tiempo, se necesita conocimiento avanzado de la composición natural del biofilm oral. Primeras etapas de la dentición permanente libres de caries con encías sanas proporcionan un hábitat subgingival ampliamente afectado que puede servir como una referencia en situ para estudiar características de la salud oral y enfermedad. Análisis del biofilm oral de los niños durante las diferentes etapas en la vida es así un tema importante en el campo. Métodos de análisis molecular moderno pueden proporcionar amplia información sobre la diversidad bacteriana de estas biopelículas. Para permitir la comparación de datos de microbiota, es importante estandarizar cada paso del procedimiento para la generación de datos moleculares. Este procedimiento abarca desde la toma de muestras clínicas, próxima generación Sequencing (NGS), procesamiento de datos bioinformáticas, interpretación taxonómica. Uno de los factores más importantes aquí es muestra de biofilm. Muestreo en los niños es incluso más difícil en particular debido al espacio limitado en áreas subgingivales. Así nos centramos en el uso de papel puntos para muestreo subgingival. Este artículo proporciona un protocolo detallado para el muestreo de biofilm oral del surco subgingival, la mucosa y saliva en los niños.
Introduction
Biofilm oral humano consta de una amplia comunidad que consiste principalmente de comensales y microorganismos beneficiosos1,2,3. Las especies encontradas aquí colonizan todos los lugares que la cavidad oral ofrece4,5,6. Composición de la biopelícula en estos nichos varía tan ampliamente como los hábitats. Saliva por ejemplo muestra diferentes perfiles bacterianos que las muestras de la placa. En muestras de placa de adultos sanos, la abundancia relativa de Actinobacteria está sobre 20%, mientras que menos del 7% se encuentra en la saliva. Bacteroidetes y Firmicutes en cambio aparecen en un número mucho mayor en saliva7. Por lo tanto, es importante muestra en diferentes lugares de la boca para obtener la imagen completa. Además, diversos factores como las diferencias geográficas y étnicas, edad, sexo y muchos otros factores hacen difícil identificar las normas generales de biofilm desarrollo y enfermedad Inicio8,9. Durante muchos años la investigación de periopathogenic y cariogénicos del biofilm ha sido una preocupación central8,10,11,12,13.
En los últimos años, la investigación sobre temas sanos ha cobrado importancia no sólo para una comprensión más amplia de la enfermedad, sino también para la aplicación de medidas preventivas14. Nuevas tecnologías y análisis moleculares más aclarar la formación del biofilm oral y función15,16y permiten el perfil completo de diversidad microbiana17,18. Se espera que también conducen a una nueva comprensión de los cambios microbianos durante la terapia ortodóntica19. Un impacto en el desarrollo de biomateriales ortodoncicos es previsible. La mejorada perspectiva arrojará nueva luz sobre las complicaciones de la terapia ortodóntica asociada a biofilm, como la desmineralización del esmalte y enfermedad periodontal12,20,21. Para permitir comparaciones de datos en todo el mundo, es fundamental estandarizar todos los pasos en la generación de datos. Cambios menores en los procedimientos de laboratorio pueden influir fuertemente en los resultados. Además, el uso de diferentes plataformas computacionales en procesamiento de datos puede conducir a conjuntos no comparables. Por último, la elección de pruebas estadísticas y correcciones tiene una influencia en los resultados. Sin embargo, el sesgo de muestreo puede ya ocurrir mucho antes de cualquier trabajo de laboratorio o comienza la bio-informática. Métodos de muestreo no normalizados conducen a un estudio inherentemente sesgado. En vista de bajos a moderados niveles de estandarización en los estudios pertinentes, poca evidencia existe sobre la relación entre ortodoncia y microbiomes19. Por lo tanto, el desarrollo de métodos estandarizados facilitaría calificado comparación de datos en el campo.
Este artículo presenta el biofilm oral estandarizado procedimientos de muestreo. El protocolo pretende contribuir a generar colecciones comparables a nivel mundial de datos de la secuencia microbiana. Se presenta un protocolo paso a paso para tomar muestras de la biopelícula oral en niños sanos. Como el método de elección, puntos de papel son atraumatically insertado dentro del surco subgingival sonido. Para facilitar las comparaciones de hábitat, mucosa de la mejilla se muestrea según el mismo protocolo. Este artículo demuestra además muestreo paralelo y combinado. Además, se muestra la toma de muestras de saliva. Un simple color-coded de transporte y sistema de almacenamiento se presenta también, facilitar el manejo de muestras para su posterior procesamiento. La elección de operaciones aguas abajo con respecto a medio de almacenamiento, análisis de metagenómica y bioinformática depende de las preguntas clínicas planteadas por diferentes campos de investigación oral. En este manuscrito, toma de muestras de ADN para NGS ha sido elegido como un ejemplo de una posible aplicación para la investigación ortodóncica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las bacterias se encuentran en todos los sitios dentro de la cavidad oral24,25,26. Muchos estudios se han centrado en el uso de saliva como medio de muestreo a mapa colonización oral, como fácilmente puede probarse a través de escupir27,28,29,30,31, 32. Sin embargo, biofilm salival no refleja la composición de la biopelícula subgingival. Así, el uso de otros métodos de muestreo es crucial para la creación de la imagen completa y evocará nuevas discusiones en la investigación dental. Varios artículos comparan el uso de Curetas y papel puntos para muestreo subgingival de sujetos periodontally enfermas8,33,34. Sin embargo ningún grupo de investigación se sabe que se han centrado en la aplicación de dispositivos de muestreo estandarizadas para los diferentes grupos de edad, especialmente para los niños19.
En este video, se presenta el biofilm oral muestreo de tres hábitats orales en niños sanos.
Modificaciones y resolución de problemas:
El objetivo del manuscrito se centra en el protocolo clínico para toma de muestras de biopelícula subgingival de niños sanos. El método de elección se refiere a sonido surcos subgingivales en espacio limitado hace muestreo especialmente desafiante. En este video se aplicó el método a dentición permanente temprana. También se puede aplicar a dentición mixta o madura y a los niños y adultos. Nuestro método permite modificaciones tales como muestras individuales o agrupadas. Este último podría ser un factor crucial para análisis moleculares debido a la pequeña cantidad de ADN coleccionable del surco subgingival saludable. La elección de los dientes índice puede modificarse bajo demanda; en particular, puede ser otro diente muestreados como una alternativa cuando el epitelio traumatizado y sangrado, por lo que el punto de papel inservible. Muestreo paralelo usando dos puntos de papel al mismo tiempo en un sitio hace repeticiones de la muestra en un solo paso, además de acortar el tiempo para los niños.
Con ligeras modificaciones se pueden degustar enfermos bolsas periodontales. Aquí puntos de papel tendrá que insertarse en toda la longitud de la cavidad, que puede alcanzar hasta 10 m. La longitud y el conus de puntos de papel, así como la profundidad de inserción debe adaptarse al hábitat intraoral de interés, pero siempre debe ser estandarizado por el material y dimensiones. También pueden tomar muestras de la mucosa con puntos de papel. Protocolos idénticos permiten comparaciones de diferentes hábitats orales y varios materiales dentales. Preparación del paciente y el almacenamiento de la muestra pueden realizarse como se describe en este video. Para la investigación de metatranscriptome, RNA puede ser muestreado con el mismo método. Así, después del muestreo, los puntos de papel deben insertarse directamente en la solución de estabilización de RNA.
Limitaciones de la técnica:
Independientemente de modificaciones, el método de muestreo clínico que describimos se limita al sonido surco subgingival. Otros sitios de muestreo, en cuanto a bolsillos periodontally enfermas de ejemplo, no eran parte de nuestro estudio de diseño. Como muestreo a la profundidad de estas bolsas es necesario, puntos de papel pueden no ser lo suficientemente grandes como para obtener muestras lo suficientemente. Si el objetivo experimental es comparar los datos de muestra de sonido surcos subgingivales y bolsillos periodontally enfermos, es importante ser consciente de la parcialidad inherente asociado a métodos de muestreo clínico diferente. Por lo tanto no es recomendable comparar dichos datos.
Una limitación del método presentado aquí es muestreo sin el uso posterior de propidio monoazide. Agregar a este agente directamente después del muestreo permite el análisis específico de sólo las células vivas en el biofilm analizado. El método de muestreo descrito aquí refleja el número de células vivas y muertas. Para la investigación de periodontitis severa, puntos de papel probablemente tendrá que ser sustituido por curetas, como formación de biofilm en bolsas profundas es fuerte. Punto de papel muestreo podría no reflejar todo el espectro microbiano en estos casos, su superficie podría saturarse demasiado rápido.
Importancia con respecto a los métodos existentes:
La propuesta es la primera de su tipo para estandarizar el muestreo subgingival en el surco sano con puntos de papel. Otros informes se han referido a la utilización de Curetas metálicas35,36 o papel puntos 37,38,39, pero no describió los procesos que tienen lugar antes de la toma de muestras, tales como control de placa, limpieza dental, diente aislamiento y secado, así como los procesos que resulten de las especificaciones inadecuadas en las líneas de tiempo y técnica de muestreo.
En los dos artículos anteriores, nos muestran que el uso de puntos de papel es un método reproducible para tomar muestras de biopelícula subgingival en niños22,40. Debido a su diseño, curetas son demasiado grandes para el surco poco profundo con espacio limitado y demasiado fuerte para el epitelio junctional tierno. Es crucial para acceder al surco subgingival sin traumatizar el epitelio. De esta manera, se evitan sesgos derivados de sangrado. Así, el uso de los puntos de papel delgado y tierno se prefiere para esta área. Puntos de papel son funcionales para monitorizar los cambios en la composición de la biopelícula durante el tratamiento ortodóntico21,41. Son delgados y flexibles entre los elementos de los aparatos ortodóncicos fijos. Esta es una gran ventaja a otros métodos de muestreo como curetas. Muestreo atraumática se simplifica y el muestreo de pequeñas cantidades de ADN es posible.
Futuras aplicaciones:
En este video demostramos el método en no enfermos, temprana, permanente dentición. También se puede aplicar a dentición mixta o madura. Con algunas adaptaciones es posible periodontally enfermos sitios como dientes o implantes y otros lugares debido a los materiales dentales de la muestra siguiendo el mismo protocolo. Investigación de caries podría beneficiarse de este protocolo estandarizado, en particular estudios sobre caries de raíz. La Conferencia más importante de nuestro muestreo de vídeo es la estandarización de los protocolos para hacer los datos comparables, sin importar qué y cómo se miden las muestras.Futuras demostraciones en video podrían mejorar el campo de la toma de muestras clínicas en general.
Biofilm oral obtenida como se muestra en el video se utiliza en clínicas y para investigaciones científicas. Este enfoque en vivo representa un buen complemento a en vitro técnicas moleculares como la hibridación en situ de la fluorescencia y láser confocal de barrido microscopía15. Métodos NGS, como la pirosecuenciación que se muestra a continuación, aplicado a la biopelícula recogida, permiten el análisis de la microbiota total. Calcular la abundancia relativa de ciertas especies bacterianas puede utilizarse para apoyar los tratamientos o para comparar diferentes pacientes o tratamientos diferentes. Junto con una secuencia estandarizada protocolo y secuencia de análisis flujo de trabajo que previamente han había descrito40, este método permite el análisis de la secuencia hasta el nivel de género. Más “meta”-estudios como estudios metatranscriptomic o metabolómica son posibles basan en el protocolo de muestreo presentado en este video.
Pasos críticos:
Evitar la contaminación es un paso crítico: instrumentos estériles tienen que aplicarse en un ambiente no estéril en vivo . La transferencia de la boca al banco deberá llevarse a cabo rápidamente y con seguridad por un examinador experimentado para mantener tiempo para los participantes del estudio lo más cortos posible. El paso más crítico en el protocolo es la inserción atraumática del punto papel dentro del surco subgingival. Alteración del epitelio del junctional y sangrado absolutamente debe evitarse. Cuidado adicional debe tenerse para no contaminar puntos de papel y frascos de almacenamiento con exógena DNA o RNA. El almacenamiento en sí mismo entonces también es un paso crítico. Las muestras deban congelarse directamente, en el mejor a −80 ° C. Esto evita cambios en la composición bacteriana post toma de muestras que falsificar resultados de secuenciación.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecemos a Joachim Theussl (centro de investigación médica, Universidad médica de Graz) por la excelente asistencia técnica en la producción de vídeo y a Mónica Farrell (gestión de la investigación, Universidad médica de Graz) como locutor.
Materials
| Paper Points Taper .02, sterilised | VDW Dental | 550 029 015 | http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&cHash= 1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2 |
| GC Cocoa Butter, Tube of 10 g | GC EUROPE N.V. | 000387 | http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22 |
| Rondells blue | DIRECTA AB | Rondell Tablets | http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767 |
| Great Lakes Nola Dry Field System | Great Lakes Ortho | 300-401 | http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626 |
| tooth brush | Oral-B | http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro | |
| micro-Ident plus11 | Hain Lifescience GmbH | 23312 | http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html |
| ParoCheck | Greiner Bio One International GmbH | 460020 | https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/ |
| Carpegen Perio Diagnostik | Carpegen GmbH | http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html | |
| tubes Reaktionsgefäße 1,5 ml | Lactan | CH77.1 to CH81.1 | www.lactan |
| cotton swabs | Henry Schein | 9003182 | www.henryschein.at |
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