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의학

건강 한 아이에서 미생물 분석을 위한 구두 Biofilm 샘플링

Published: December 31, 2017
doi:
10.3791/56320
, ,
1Division of Oral Surgery and Orthodontics, Department of Dental Medicine and Oral Health,Medical University of Graz, 2Division of Preventive and Operative Dentistry, Periodontology, Prosthodontics and Restorative Dentistry, Department of Dental Medicine and Oral Health,Medical University of Graz

Summary

어린 시절 내내 구강 미생물에 변화는 성장 하는 관심사의 이다. 다른 미생물 연구의 비교는 표준화 된 샘플링 프로토콜의 부족을 보여준다. 제한 된 공간 샘플링 어려운 이들의 사운드 subgingival 고 랑을 만든다. 종이 포인트 샘플링은이 지역에 대 한 선택의 방법으로 자세히 여기 표시 됩니다.

Abstract

구두 biofilm 및 분자 분석 조사 하는 다양 한 치과 연구와 임상 질문에 대 한 기초를 제공 합니다. Biofilm 구성의 기술 cariogenic와 periopathogenic 메커니즘의 더 나은 이해에 지도 한다. 미생물 변화는 구강에서 어린 시절 동안 관심의 여러 가지 이유로 있습니다. 아동 구두 microbiota와 그것의 구성의 변화에의 진화 이해 하 고 질병의 발병을 예방할 가능성이 더 분석할 필요가 있다. 같은 시간에 구두 biofilm의 천연 성분의 고급 지식이 필요 합니다. 건강 한 잇 몸 가진 카 리에 스 프리 영구 치열의 초기 단계는 널리 영향을 받지 않는 subgingival 구강 건강 및 질병의 특징을 공부에 대 한 현장에서 기준으로 사용할 수 있는 서식 지를 제공 합니다. 인생에서 다른 단계 동안 어린이 구강 biofilm의 분석은 따라서 분야에서 중요 한 테마 이다. 현대 분자 분석 방법 같은 biofilms의 세균성 다양성에 대 한 포괄적인 정보를 제공할 수 있습니다. Microbiota 데이터 비교를 사용 하려면 그것은 분자 데이터 생성 과정의 각 단계를 표준화 하는 것이 중요입니다. 이 절차는 분류학 해석에 임상 샘플링, 다음 세대 시퀀싱 (NGS), bioinformatic 데이터 처리에서 걸쳐. 여기에 가장 중요 한 요소 중 하나는 biofilm 샘플링입니다. 아이 들에 있는 샘플링은 subgingival 지역에서 제한 된 공간 때문에 특히 더 많은 도전. 우리는 따라서 subgingival 샘플링에 대 한 종이 포인트의 사용에 집중 한다. 이 문서는 subgingival 고 랑, 점 막, 그리고 아이 들에 있는 타 액의 구강 biofilm 샘플링에 대 한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

Introduction

인간의 구강 biofilm 공생의 유익한 미생물1,,23주로 구성 된 광범위 한 지역 사회를 함유 한다. 여기 종 식민지 모든 틈새는 구강4,,56을 제공 하는 것. 이러한 틈새에서 Biofilm 구성으로 서식 지로 널리 다릅니다. 타 액은 예 패 샘플 보다 다른 세균 프로필을 표시합니다. 건강 한 성인의 패 샘플, Actinobacteria 의 상대 풍부한에서는 이상 20%, 7% 미만 타 액에서 발견 되는 동안입니다. Bacteroidetes 및 Firmicutes 반면 타 액7에 훨씬 더 높은 숫자에 표시 됩니다. 따라서, 전체 그림을 얻기 위하여 입에서 서로 다른 위치에 샘플을 중요 하다. 또한, 지리적, 민족적인 차이, 나이, 성별, 그리고 다른 많은 요인 등 다양 한 요인을 확인 biofilm 개발 및 질병 발병8,9에 대 한 일반적인 규칙을 식별 하기가 어렵습니다. 몇 년 동안 periopathogenic 및 cariogenic biofilm의 조사는 중앙 우려8,10,11,,1213되었습니다.

최근 몇 년 동안, 건강 한 과목에 대 한 연구 뿐만 아니라 질병의 광범위 한 이해 뿐만 아니라 예방 조치14의 구현에 대 한 중요성을 얻고 있다. 새로운 기술 및 분자 분석 또한 구두 biofilm 형성 및 기능15,16, 명료 하 고 미생물 다양성17,18의 완전 한 프로 파일링을 활성화 합니다. 이 또한 교정 치료19동안 미생물 변화의 새로운 이해로 이어질 예정 이다. 교정 생체 재료의 개발에 영향 예측 이다. 향상 된 관점 biofilm에 나 멜 demineralization 등 치 주 질환12,,2021와 관련 된 교정 치료의 합병증에 새로운 빛 창 고 것입니다. 전세계 데이터 비교를 허용 하려면 데이터 생성에서 모든 단계를 표준화 하기 결정적 이다. 실험실 절차에 사소한 변화 강력 하 게 결과 좌우할 수 있다. 또한, 다양 한 데이터 처리에 컴퓨터 플랫폼의 사용 비 비교 데이터 집합 발생할 수 있습니다. 마지막으로, 통계적 테스트 및 교정의 결과에 영향이 있다. 그러나, 이미 오래 전에 어떤 실험실 작업 발생 수 샘플링 바이어스 또는 개시 바이오 컴퓨팅. 비 표준화 된 샘플링 메서드는 본질적으로 편 파 연구 이어질. 표준화 관련 연구에서의 적당 한 수준 낮은, 보기 작은 증거 교정 및 microbiomes19사이의 관계에 존재합니다. 따라서, 표준화 된 방법의 개발 용이 하 게 하는 필드에 데이터의 자격된 비교 것입니다.

이 문서는 표준화 된 구강 biofilm 샘플링 절차를 선물 한다. 프로토콜은 세계적으로 대 등 한 미생물 시퀀스 데이터 컬렉션을 생성 하는 쪽으로 기여 하는 위한 것입니다. 건강 한 아이 들에 있는 구두 biofilm 샘플링에 대 한 단계별 프로토콜 제공 됩니다. 선택 하는 방법으로 종이 포인트 삽입된 들은 사운드 subgingival 고 랑에는. 서식 지 비교를 촉진 하기 위하여 뺨 점 막 같은 프로토콜에 따라 샘플링 됩니다. 이 문서는 또한 병렬 및 풀링된 샘플링을 보여 줍니다. 또한, 침 샘플링 표시 됩니다. 간단한 색 전송 및 스토리지 시스템도 추가 처리를 위해 표본 관리를 용이 하 게 제공 됩니다. 저장 매체, metagenomic 분석과 생물 정보학에 관한 다운스트림 작업의 임상 질문 구두 연구에 다른 분야에 의해 제기에 따라 달라 집니다. 이 원고에서 NGS의 DNA 샘플링 교정 연구 가능한 응용 프로그램의 예제로 선정 되었습니다.

Protocol

프로토콜 및 비디오 촬영은 그라츠의 의학 대학 (Votum 27-126ex14/15)의 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다. 이 비디오 게시에 대 한 서 면된 동의 자녀와 그녀의 부모에서 얻은 했다. 1. 기기 및 재료 컷 보정 (ISO 015/02) 고 메 마른 종이 포인트, 그들의 길이 (그림 1)을 표준화 하기 위해 첫 번째 링 마크에 endodontic 치료에 주로 사용 됩니다. 260에 자외선 빛 방사선 적용 종이 포인트 (그림 2)의 DNA와 RNA 오염을 방지 하기 위하여 30 분 nm. 고압 튜브 120 ° C와 1.2 저장용 바 20 분 및 UV 비추는 그들 뿐만 또는 고용 준비-사용 감마 방사선 튜브. 2입니다. 과목의 준비 참고: 서 면된 동의 자녀와 등록 전에 그녀의 부모에서 얻은 했다. 입술에 코코아 버터를 적용 됩니다. 뺨을 탑재 하 고 혀를 두 치과 아치에 대 한 전체 액세스에 대 한 견인. 플 라크 공개와 함께 치과 플 라크를 착 색. 건조 필드 장치를 제거 합니다. 물 무색이 될 때까지 물으로 입을 헹 구 십시오. 브러쉬 철저 하 게 45 ° angulation에서 전기 칫 솔과 치아. 이 구두 biofilm를 변경할 것 이다 아무 치약, 하지만 물을 적용 합니다. 혀 가드 입 오픈 하 고 건조 유지를 포함 하 여 다시 건조 필드 장치를 탑재 합니다. 깨끗 하 고 마른 종이 동안 supragingival 액체의 흡수를 피하기 위해 멸 균 면봉으로 인덱스 치아 샘플링 포인트. 3. Biofilm 샘플링 Subgingival 고 랑의 포인트 샘플링 종이 살 균 치과 핀셋으로 종이 포인트를 파악. 접선 최대 4mm의 정의 된 길이에 종이 포인트를 삽입 합니다. 접합 상피 (그림 3)에 게 충격을 하지 특별 한 주의 분리 했습니다. 20 후 제거 하는 종이 포인트 s. 준비 된 튜브에 직접 종이 포인트를 수집: 종이 포인트 팁 직접 살 균 하 고 DNA 유리병에 놓고 4 mm (그림 4)의 표준된 길이를 3 마크에 잘라. 연구 프로토콜에 지정 된 경우 두 종이 포인트 병렬 및 동시에 같은 사이트 (그림 5A)에 삽입 합니다. 연구 프로토콜 “풀링된 샘플”에서 요구 하는 경우 또는 여러 사이트에서 종이 포인트 수집 (그림 5B). 건조 필드 장치 제거 점 막과 침 샘플링. 점 막 종이 포인트 샘플링 (그림 6) 위 뺨의 vestibular 배 종이 포인트 적용. 뺨을 닫고 짧게 마사지 합니다. 뺨을 열고 20 후 제거 하는 종이 포인트 s. 3 마크에 종이 포인트를 잘라내어 subgingival 샘플링 된 무 균 튜브에 넣어. 침 샘플링 자녀가 소독된 컬렉션 그릇 (그림 7)에 unstimulated 타 액을 뱉 어 봅시다. 4. 전송 및 저장 연구 설계 (그림 8)에 따라 단일, 풀, 또는 병렬 샘플으로 종이 포인트를 수집 합니다. 샘플 관리 (그림 9)를 더 촉진 하기 위해 색으로 구분 된 스토리지 시스템을 적용 합니다. 마지막으로, 미생물 분석 중인 −80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.

Representative Results

현재 발행물에서 NGS의 DNA 샘플링은 교정 연구 가능한 응용 프로그램의 예를 들어 설명 했다. 세균성 DNA는 종이 포인트 샘플에서 직접 추출 됩니다. 이 DNA에 대 한 미생물 구성의 연구에 사용할 수 있습니다 임상 질문 ( 그림10에서) 요약를 연구 또는. NGS 방법 454-pyrosequencing 같은 현대 분자 분석 방법 샘플의 완전 한 microbiota에 대 한 개요를 제공합니다. 박테리아의 수천의 DNA 식별 동시에 서로 다른 계통 발생 수준에서는 16 이상 rRNA 순서 차이. Bioinformatic 플랫폼 정보 큰 데이터 집합에서 검색 된 클러스터로 구축 하는 수단으로 생성 될 필요가 있다. 통계 분석은 다음 microbiota 데이터 집합에 적용할 수 있습니다. 서식 지 조건 변경 인해 microbiota에 교대를 할 수 있는 특정 세균 종의 전반적으로 관계 되는 풍부를 분석할 수 있습니다. 가로 막대형 차트 (그림 11) 및 heatmaps (그림 12) 주문 수준 또는 문 수준에서 subgingival 세균성 구성을 표시 됩니다. 다양 한 개인 및 치료 설명 및 날개 식 통계에 의해 비교할 수 있습니다. 그림 13 subgingival 종이 포인트 서로 다른 분류학 수준에서 샘플링의 두 가지 모드의 히스토그램 비교를 제공 합니다. 표 1 은 생체 외에서 연구를 비교 하는 두 시간 포인트 (T1 및 T3) 동안 biofilm 구성에 변화를 보여준다. 통계적으로 유의 한 변화는 Wilcoxon 서명 순위 테스트와 454-pyrosequencing 데이터에서 다음 Bonferroni 보정 계산 했다. 마지막으로, 주 좌표 분석 (PCoA)로 다른 샘플에서 확인 된 조작 상 분류학 단위 (OTU) 수준에서 직접 3D 비교 수 있습니다. 그림 14에서 PCoA 플롯 5 어린이의 케이스 시리즈에서 subgingival 미생물의 내부와 통해 개인 차이 표시합니다. 그림 15 는 교정 사례 제어 연구의 결과 보여줍니다: 분홍색 빨간 점 경우, 빛이 어두운 파란색 점들은 컨트롤, 4 개월의 기간 동안 반복 해 서 모든 샘플된. (빨간 점) 교정 개입 후의 경우 분명 클러스터링은 미생물에 변화가 나타냅니다. 컨트롤 그룹을 나타내는 파란색 점 균등 하 게 배포 됩니다. 그림 1 : 표준된 길이의 종이 포인트 준비. 살 균 된 종이 포인트 그들의 길이 표준화 하기 위한 첫 번째 링 마크에서 잘립니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2 : Sterilize 및 DNA에서 무료 포인트. 표준화 된 종이 포인트는 소독 하 고 깨끗 한 벤치에 UV 방사선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3 : Subgingival 종이 포인트 삽입. 살 균 된 종이 포인트 20 4 m m 링 마크까지 subgingival 고 랑에 접선 삽입 됩니다 s. 그림 4 : 종이 포인트 튜브로 절단. 직접 샘플링, 후 종이 포인트 3 링 마크 (4mm)에 살 균 및 DNA-무료 1.5 mL 유리병에 잘라. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 5 : 풀링된 및 병렬 샘플링. 두 종이 포인트는 하나의 치아 (A) 또는 여러 치아 (B)의 subgingival sulci로 여러 종이 포인트의 subgingival 고 랑에 동시에 삽입 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 6 : 점 막 샘플링. 살 균 된 종이 포인트는 vestibular의 점 막에 누워 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 7 : 타 액 컬렉션. Unstimulated 타 액 살 균 비 커에 침을 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 8 : 샘플링 계획. 단일 (왼쪽, 1 개의 치아), 풀링 (여러 한 유리병에 모든 줄무늬), 또는 병렬 (블루 줄무늬, 하나의 치아에 두 종이 포인트) 샘플 샘플을 수집할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 9 : 스토리지 색. 추천 색상 코드 시트와 튜브를 용이 하 게 위한 추가 처리 샘플.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 10 : Subgingival biofilm 분석. 임상 biofilm 샘플링 (A), DNA 추출 (B), 및 다른 NGS 기술 (C)의 도식 프리젠테이션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 11 : 바 차트. 보기 454-pyrosequencing를 사용 하 여 분석 하는 문 수준에서 박테리아의 관계 되는 풍부. Santigli 그 외 여러분 에서 수정 이미지 22 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 12 : Heatmap. 보기 세균성 명령 사용 하 여 분석의 상대적 나타났는데 454-pyrosequencing. 진한 빨간색 높은 관계 되는 풍부를 나타냅니다 (> 10%). 진한 파란색 각각 세균 순서의 아무 상대적 풍요에는 매우 낮은 나타냅니다. Santigli 그 외 여러분 에서 수정 이미지 22 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 13 : 히스토그램. 종이의 두 가지 모드의 비교 포인트 샘플링 (A와 B 모드) 다른 분류학 수준에. 454 pyrosequencing로 생성 된 데이터입니다. Santigli 그 외 여러분 에서 수정 이미지 22 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 14 : 2D PCoA 음모. 케이스 시리즈 (n = 5) (1 개의 색깔은 1 주제) 두 subgingival 샘플링 방법 결과로 내 개인과 개인 간 차이 보여주는. 454 pyrosequencing로 생성 된 데이터입니다. Santigli 그 외 여러분 에서 수정 이미지 22 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 15 : 3D PCoA 작 애니메이션의 스냅숏. 표시 subgingival 미생물 이동 교정 케이스 컨트롤 연구에서 (n = 16, 각 그룹, 시간;에 3 포인트 경우: 분홍색 빨간색, 컨트롤: 진한 파란색 빛). 454 pyrosequencing로 생성 된 데이터입니다.작업 그룹 Santigli에서에서 게시 되지 않은 데이터입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. Taxon: Bacteriae 시간 포인트 1 [%] 시간 포인트 3 [%] Wilcoxon 서명 순위 테스트 문/속 25 중간 75 25 중간 75 p-값 p-값 조정 # 다른 다른 0.70 1.07 1.28 1.32 1.63 1.93 .000 .005 Actinobacteria 放 0.00 0.04 0.13 0.06 0.30 0.97 .001 .021 Rothia 0.00 0.00 0.05 0.00 0.13 0.32 .001 .009 Bacteroidetes Prevotella 0.00 0.01 0.22 0.15 1.02 2.44 .000 .006 Firmicutes 다른 (이십시오) 0.00 0.01 0.06 0.00 0.04 0.10 .706 1.000 포도 상 구 0.00 0.01 0.12 0.00 0.07 0.17 .548 1.000 (Gemellaceae) 0.00 0.00 0.07 0.12 0.77 1.24 .005 .091 (Lactobacillales) 0.00 0.00 0.04 0.00 0.12 1.50 .004 .073 Granulicatella 0.09 0.23 0.37 0.64 1.59 2.28 .000 .003 유산 균 0.00 0.00 0.18 0.00 0.00 0.04 .700 1.000 기타 (Streptococcaceae) 0.00 0.04 0.13 0.00 0.10 0.19 .768 1.000 (Streptococcaceae) 0.04 0.10 0.23 0.12 0.37 0.69 .005 .083 연쇄 상 구 균 53.42 61.96 88.38 48.44 60.83 73.97 .055 .930 기타 (Lachnospiraceae) 0.00 0.00 0.01 0.00 0.00 0.11 .003 .058 Dialister 0.00 0.00 0.04 0.00 0.00 0.04 .240 1.000 Veillonella 3.43 27.15 42.78 6.69 13.38 27.05 .157 1.000 Proteobacteria Haemophilus 0.00 0.00 0.03 0.31 0.84 2.38 .000 .008 #p-값 Wilcoxon 서명 순위 테스트 조정 따라 Bonferroni 보정 P < 0.0026 중요 하 게 고려 되었다 표 1: 통계 분석. 시간에 두 지점에서 건강 한 어린이의 구강 미생물에 차이. 454 pyrosequencing로 생성 된 데이터입니다. Klug 외 에서 수정 이미지 23

Discussion

박테리아는 구강24,,2526내의 모든 사이트에서 발견 된다. 많은 연구27,,2829,30,31, 침 통해 쉽게 샘플링할 수 수로 구두 식민지를 지도 하는 샘플링 매체로 타 액의 사용에 초점을 맞춘합니다 32. 그러나, 침 biofilm subgingival biofilm 구성을 반영 하지 않습니다. 따라서, 다른 샘플링 방법의 사용은 전체 그림을 만들기 위한 매우 중요 하 고 치과 연구에 새로운 토론을 연상 됩니다. 몇 가지 기사 periodontally 질병 과목8,,3334의 subgingival 샘플링에 대 한 curettes 및 종이의 사용을 비교합니다. 아직 아무 연구 그룹은 특히 어린이19에 대 한 서로 다른 연령 그룹에 대 한 표준화 된 샘플링 장치 응용 프로그램에 초점을 맞춘 것 알려져 있다.

이 비디오에서는, 건강 한 아이 들에 있는 3 개의 구두 서식 지의 구두 biofilm 샘플링 제공 됩니다.

수정 및 문제 해결:

원고의 목표는 건강 한 어린이의 subgingival biofilm 샘플링에 대 한 임상 프로토콜에 중점을 둡니다. 방법의 선택 소리 subgingival sulci를 제한 된 공간 만드는 특히 도전 샘플링을 말합니다. 이 비디오에서는 메서드가 영구 치열 초기에 적용 되었습니다. 그것은 또한 혼합 또는 성숙한 치열 하 고 아이 들 또는 성인을 적용할 수 있습니다. 우리의 샘플링 방법을 하나 또는 풀링된 샘플 등 수정 할 수 있습니다. 후자의 건강 한 subgingival 고 랑에서 수집 DNA의 작은 금액으로 인해 분자 분석에 대 한 중요 한 요인이 될 수 있습니다. 인덱스의 선택에; 수정할 수 있습니다. 특히, 다른 치아 상피 충격 때 대신 샘플 및 출혈, 따라서 종이 포인트를 사용할 수 없게 만드는 수 있습니다. 한 사이트에서 동시에 두 개의 종이 포인트를 사용 하 여 병렬 샘플링 샘플 복제 어린이 들을 위한의 자 시간을 단축 하는 것 외에도 한 번에 렌더링 합니다.

약간의 수정으로 병 치 주 주머니를 샘플링할 수 있다. 여기 종이 포인트 최대 10 m m를 도달할 수 있는 주머니의 전체 길이를 삽입 해야 합니다. 길이 삽입의 깊이 뿐만 아니라 종이 포인트 conus 관심의 intraoral 서식 지에 적응 해야 하지만 항상 재료와 크기에 의해 표준화 되어야 한다. 샘플은 또한 종이 포인트를 사용 하 여 점 막에서 반입할 수 있습니다. 동일한 프로토콜 다른 구두 서식 지와 다양 한 치과 재료의 비교를 허용 한다. 환자 준비 및 샘플 저장이이 비디오에 설명 된 대로 수행할 수 있습니다. Metatranscriptome 연구에 대 한 RNA 같은 방법으로 샘플링 될 수 있습니다. 따라서, 샘플링, 후 종이 포인트는 RNA 안정화 솔루션에 직접 삽입 해야 합니다.

기술의 한계:

수정에 설명 임상 샘플링 방법 사운드 subgingival 고 랑으로 제한 됩니다. 예 periodontally 병 주머니에 관해서는 다른 샘플링 사이트의 우리의 연구 설계 되지 않았습니다. 이러한 주머니의 전체 깊이를 샘플링을 필요에 따라 종이 포인트 충분히 샘플을 수집 하기에 충분 하지 않을 수 있습니다. 실험 목표 하는 경우 사운드 subgingival sulci 및 periodontally 병 주머니에서 샘플링 한 데이터를 비교, 그것은 다른 임상 샘플링 방법와 연결 된 고유한 바이어스에 자각 하는 것이 중요. 그것은 따라서 이러한 데이터를 비교 하는 것이 좋습니다입니다.

여기에 제시 된 방법의 한계는 propidium monoazide의 후속 사용 없이 샘플링 됩니다. 샘플링 후 직접이 에이전트를 추가 분석 하는 biofilm에서 살아있는 세포만의 특정 분석에 대 한 수 있습니다. 여기 설명 하는 샘플링 방법을 생활과 죽은 세포의 수를 반영 합니다. 심한 치 주 염의 연구, 종이 포인트 깊은 주머니에 biofilm 형성은 강력한 아마 curettes, 교체 필요 합니다. 종이 포인트 샘플링 그들의 표면으로 이러한 경우에, 전체 미생물 스펙트럼을 반영 하지 않을 수도 있습니다 너무 빨리 포화 될 수 있습니다.

기존의 방법에 관하여 의미:

제안 된 원고 종이 포인트와 함께 건강 한 고 랑에 subgingival 샘플링을 표준화 하는 그것의 종류의 첫번째 이다. 다른 보고서는 금속 curettes35,36 의 사용 또는 종이 37,,3839, 가리키지만 샘플링, 이전 수행 하는 프로세스를 설명 하지 않았다 등 플 라크 컨트롤로 치아 치아 격리, 청소 및 건조, 샘플링 기술과 시간 라인에 부적당 한 사양에서 발생 하는 프로세스 뿐만 아니라.

두 이전 기사에서 우리는 종이 포인트를 사용 하 여 어린이22,40subgingival biofilm 샘플링에 대 한 재현 방법입니다 보여줍니다. 때문에 그들의 디자인, curettes는 제한 된 공간 얕은 고 랑에 대 한 너무 크고 너무 부드러운 접합 상피에 대 한 날카로운. 그것은 subgingival 고 랑 상피 traumatizing 없이 액세스할 수 중요 합니다. 이 방법에서는, 바이어스 출혈에서 발생 하는 피 한다. 따라서, 슬림 하 고 부드러운 종이 포인트의 사용은이 지역에 대 한 선호. 종이 포인트 교정 치료21,41동안 biofilm 구성 변경 사항을 모니터링 하는 기능입니다. 그들은 슬림 하 고 고정 교정 기기 요소 사이 맞게 충분히 유연입니다. 이것은 curettes 같은 다른 샘플링 방법에 중요 한 이점은 이다. Atraumatic 샘플링 간소화 하 고 DNA의 적은 양의 샘플링 가능 하다.

미래의 응용 프로그램:

이 비디오에서 우리는 비 병에 걸리는, 초기, 영구 치열에 메서드 시연. 그것은 또한 혼합 또는 성숙한 치열에 적용할 수 있습니다. 일부 각 색 같은 프로토콜에 따라 치아 나 임 플 란 트 및 치과 재료 때문 다른 틈새 같은 periodontally 질병 사이트 샘플 가능 하다. 카 리에 스 연구는 뿌리 카 리에 스에 대 한 특정 연구에이 표준화 된 프로토콜에서 유익할 수 있었다. 데이터 비교, 아무리 무엇을 하 고 샘플을 측정 하는 방법을 수 있도록 프로토콜의 표준화는 우리의 샘플링 비디오에서 가장 중요 한 강의입니다.미래의 비디오 데모의 일반적 임상 샘플링 필드 향상 시킬 수 있습니다.

비디오와 같이 얻은 구두 biofilm 과학적 조사에 대 한 클리닉에 사용 됩니다. Vivo에서 이렇게 형광 제자리에서 교 잡, confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법15등 생체 외에서 분자 기법에 대 한 좋은 추가 나타냅니다. NGS 방법, 그림과, pyrosequencing로 전체 microbiota의 분석 수 수집된 biofilm에 적용. 또는 치료를 지 원하는 다른 환자 또는 다른 처리를 비교 하 여 특정 세균성 종 상대 나타났는데 계산을 사용할 수 있습니다. 표준화 된 시퀀싱 프로토콜 및 시퀀스 분석 워크플로 함께 우리는 이전40설명,이 샘플링 방법 속 수준 시퀀스 분석을 수 있습니다. “메타” 추가-연구가이 비디오에 제시 샘플링 프로토콜에 기반 하는 metatranscriptomic 또는 metabolomic 수 있습니다.

중요 한 단계:

중요 한 단계는 오염 방지: 무 균 악기 비 살 균 비보에 환경에 적용할 수 있다. 벤치에는 입에서 전송 가능한 연구 참여자에 대 한의 자 시간을 유지 하는 경험 있는 심사 관에 의해 신속 하 고 안전 하 게 수행할 수 있다. 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 subgingival 고 랑에 종이 포인트의 atraumatic 삽입입니다. 접합 상피 및 절대적으로 출혈의 방해를 피할 수 있다. 추가 관리 종이 포인트 및 스토리지 튜브 외 인 DNA 또는 RNA를 오염 하지 위해서는 주의가 있다. 스토리지 자체 다음 또한 중요 한 단계 이다. 샘플은 −80 ° c.에서 직접, 기껏해야 얼 필요가 이 시퀀싱 결과 위조 것 세균성 구성 게시물 샘플링에 변화를 방지 합니다.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 요 아 킴 Theussl (의료 연구 센터, 의료 그라츠 대학)에 우수한 기술 지원에 대해 모니카 파렐 (연구 관리, 그라츠의 의학 대학)와 비디오 제작에 음성 재능으로 감사.

Materials

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Carpegen Perio Diagnostik Carpegen GmbH http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html
tubes Reaktionsgefäße 1,5 ml Lactan CH77.1  to CH81.1 www.lactan
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References

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Santigli, E., Koller, M., Klug, B. Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children. J. Vis. Exp. (130), e56320, doi:10.3791/56320 (2017).
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