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의학

Biofilm orali campionamento per l'analisi di Microbiome nei bambini sani

Published: December 31, 2017
doi:
10.3791/56320
, ,
1Division of Oral Surgery and Orthodontics, Department of Dental Medicine and Oral Health,Medical University of Graz, 2Division of Preventive and Operative Dentistry, Periodontology, Prosthodontics and Restorative Dentistry, Department of Dental Medicine and Oral Health,Medical University of Graz

Summary

Cambiamenti nel microbioma orale per tutta l’infanzia sono di crescente interesse. Confronto tra diversi microbiome studi rivela una mancanza di protocolli di campionamento standardizzati. Spazio limitato rende il solco subgengivale suono dei bambini impegnativi di campionamento. Carta del punto di campionamento è presentato qui in dettaglio come il metodo di scelta per questa zona.

Abstract

Biofilm orali e la sua analisi molecolari forniscono una base per indagare vari dental research e quesiti clinici. Conoscenza della composizione di biofilm conduce ad una migliore comprensione dei meccanismi cariogeni e parodontopatogene. Microbici cambiamenti che avvengono nella cavità orale durante l’infanzia sono di interesse per diversi motivi. L’evoluzione del microbiota orale bambino e cambiamenti nella sua composizione devono essere ulteriormente analizzati per capire e possibilmente prevenire l’insorgenza della malattia. Allo stesso tempo, è necessaria la conoscenza avanzata della composizione naturale dei biofilm orali. Prime fasi della dentizione permanente niente carie con gengive sane forniscono un habitat subgingival ampiamente inalterato che può servire come una previsione in situ per lo studio delle caratteristiche di salute orale e malattia. Analisi del biofilm orali dei bambini durante le diverse fasi nella vita sono dunque un tema importante nel campo. Metodi di analisi molecolare moderna possono fornire informazioni complete circa la diversità batterica di tali biofilm. Per consentire il confronto di dati di microbiota, è importante standardizzare ogni passaggio della procedura per la generazione di dati molecolari. Questa procedura si estende dall’elaborazione dei dati di campionamento clinica, Next Generation Sequencing (NGS), bioinformatica, interpretazione tassonomica. Uno dei fattori più critici qui è il campionamento di biofilm. Campionamento in bambini è ancora più difficile in particolare a causa di spazio limitato nelle aree sottogengivale. Così ci concentriamo sull’uso di punte di carta per il campionamento sottogengivale. Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per il campionamento di biofilm orali del solco subgengivale, mucosa e saliva in bambini.

Introduction

Biofilm orale umana comprende una vasta comunità composta prevalentemente da commensali e microrganismi benefici1,2,3. Specie che si trovano qui colonizzare tutte le nicchie che la cavità orale offre4,5,6. Composizione di biofilm in queste nicchie varia ampiamente quanto gli habitat. Saliva, ad esempio, Visualizza diversi profili batterici rispetto a campioni di placca. In campioni di placca di adulti in buona salute, l’abbondanza relativa di Actinobacteria è oltre 20%, mentre meno del 7% si trova nella saliva. Bacteroidetes e Firmicutes al contrario appaiono in numero molto più elevato in saliva7. Pertanto, è importante per esempio alle posizioni differenti in bocca al fine di ottenere l’intera immagine. Inoltre, diversi fattori quali le differenze geografiche ed etniche, età, sesso e molti altri fattori rendono difficile identificare regole generali per biofilm sviluppo e malattia inizio8,9. Per molti anni l’indagine di parodontopatogene e cariogeni biofilm è stata una preoccupazione centrale8,10,11,12,13.

Negli ultimi anni, la ricerca su soggetti sani ha acquisito importanza non solo per una più ampia comprensione della malattia, ma anche per l’attuazione di misure preventive14. Nuove tecnologie e analisi molecolari ulteriormente delucidare la formazione di biofilm orali e funzione15,16e abilitare la profilatura completa di diversità microbica17,18. Questo dovrebbe portare anche a una nuova comprensione delle modifiche microbiche durante la terapia ortodontica19. Un impatto sullo sviluppo di Biomateriali ortodontici è prevedibile. La prospettiva avanzata verrà gettato nuova luce sulle complicazioni della terapia ortodontica associata a biofilm, come la demineralizzazione dello smalto e malattie parodontali12,20,21. Per consentire il confronto dei dati in tutto il mondo, è fondamentale per standardizzare tutti i passaggi nella generazione dei dati. Piccole modifiche nelle procedure di laboratorio possono influenzare fortemente i risultati. Inoltre, l’uso di diverse piattaforme di calcolo nell’elaborazione dei dati può portare ai set di dati non comparabili. Infine, la scelta dei test statistici e correzioni ha un’influenza sui risultati. Tuttavia, bias di campionamento può verificarsi già a lungo prima di qualsiasi lavoro di laboratorio o inizia la bio-informatica. Metodi di campionamento non standardizzate portano ad uno studio di inerentemente polarizzato. In considerazione del basso a livelli moderati di standardizzazione negli studi, poca prova esiste sul rapporto tra ortodonzia e microbiomi19. Di conseguenza, lo sviluppo di metodi standardizzati faciliterebbe qualificato confronto dei dati nel campo.

Questo articolo presenta biofilm orale standardizzato le procedure di campionamento. Il protocollo è destinato a contribuire a generare globalmente paragonabile collezioni di dati di sequenza microbica. È presentato un protocollo passo-passo per il campionamento di biofilm orali in bambini sani. Come il metodo di scelta, punte di carta sono inserito atraumatically nel solco subgengivale suono. Per facilitare i confronti habitat, mucosa guancia è prelevata secondo lo stesso protocollo. Questo articolo viene illustrato inoltre campionamento parallelo e pool. Inoltre, è dimostrato campione di saliva. Un semplice color-coded trasporto e sistema di archiviazione viene presentato, facilitare la gestione dei campioni per l’ulteriore elaborazione. La scelta delle operazioni a valle per quanto riguarda il supporto di archiviazione, analisi metagenomica e bioinformatica dipende da questioni cliniche di diversi ambiti della ricerca orale. In questo manoscritto, campionamento del DNA per NGS è stato scelto come esempio di una possibile applicazione per la ricerca ortodontico.

Protocol

Protocollo e riprese video sono state approvate dal comitato di revisione istituzionale dell’Università medica di Graz (Votum 126ex14-15/27). Consenso scritto per la pubblicazione dei video è stato ottenuto da suo padre e il figlio. 1. gli strumenti e materiali Taglio calibrato (ISO 015/02) e punte di carta sterili, solitamente utilizzati in terapia endodontic, alla prima boa anello al fine di standardizzare la loro lunghezza (Figura 1). Applicare l’irradiazione di luce UV a 260 nm per 30 min al fine di evitare la contaminazione del DNA e RNA di punte di carta (Figura 2). Autoclave i tubi per l’archiviazione a 120 ° C e 1.2 bar per 20 min e UV-irradiare li pure o impiegano ready-to-use gamma irradiati tubi. 2. preparazione di soggetti Nota: Il consenso informato scritto è stato ottenuto dal bambino e suo padre prima dell’arruolamento. Applicare burro di cacao per le labbra. Montare sulla guancia e lingua riavvolgitore per accesso completo su entrambe le arcate dentali. Macchia la placca dentale con divulgazione di placca. Rimuovere l’apparecchio di campo asciutto. Sciacquare la bocca con acqua fino a quando l’acqua è incolore. Spazzolare accuratamente i denti con un spazzolino da denti elettrico presso l’angolazione di 45 °. Applicare acqua solo ma nessun dentifricio, come ciò modificherebbe il biofilm orale. Montare l’apparecchio di campo asciutto nuovamente, compresa la guardia di linguetta per mantenere la bocca aperta e asciutta. Asciutto e pulito i denti di indice con tamponi di cotone sterile per evitare un assorbimento del fluido sopragengivale durante carta punto di campionamento. 3. Biofilm campionamento Punto di campionamento del solco subgengivale del foglio Afferrare i punti di carta con una pinzetta dentale sterile. Inserire carta punti tangenzialmente fino a una lunghezza definita di 4 mm. Fare attenzione di non traumatizzare l’epitelio giunzionale (Figura 3). Rimuovere la carta punti dopo 20 s. Raccogliere punti carta direttamente nelle provette preparate: posizionare la carta punto punta direttamente in un flacone sterile e privo di DNA e tagliarlo al terzo interrogativo ad una lunghezza standard di 4 mm (Figura 4). Se indicato dai protocolli di studio, inserire due punti carta parallelamente e simultaneamente nello stesso sito (Figura 5A). In alternativa, raccogliere punti carta da diversi siti, se il protocollo di studio richiede “pool di campioni” (figura 5B). Rimuovere l’apparecchio di campo asciutto per la mucosa e campionamento di saliva. Carta della mucosa punto di campionamento Applicare i punti di carta per la piega vestibolare della guancica superiore (Figura 6). Chiudere la guancia e massaggiare brevemente. Aprire la guancia e rimuovere i punti di carta dopo 20 s. Tagliare la carta punti al terzo interrogativo e metterli in una provetta sterile come indicato per il campionamento sottogengivale. Campionamento di saliva Lasciate che il bambino sputare saliva non stimolata in un recipiente di raccolta sterilizzati (Figura 7). 4. trasferimento e deposito Raccogliere punti carta come campioni singoli, pool o paralleli a seconda del disegno dello studio (Figura 8). Applicare un sistema di storage con codifica a colori per facilitare ulteriormente la gestione dei campioni (Figura 9). Infine, conservare i campioni a − 80 ° C in attesa di analisi microbioma.

Representative Results

Nella presente pubblicazione, campione di DNA per NGS è ha dimostrato come un esempio di una possibile applicazione per la ricerca ortodontico. DNA batterico è estratta direttamente dai campioni di punto di carta. Questo DNA quindi può essere utilizzato negli studi della composizione microbica per cliniche o domande di ricerca (come sintetizzato nella Figura 10). Metodi di analisi molecolare moderna come il metodo NGS 454-pyrosequencing dare una panoramica del microbiota completa di un campione. Il DNA di migliaia di batteri è identificato simultaneamente a diversi livelli filogenetici sopra il 16s differenze di sequenza del rRNA. Bioinformatic piattaforme devono essere generati come mezzo di strutturazione in cluster le informazioni recuperate da grandi insiemi di dati. Analisi statistica può quindi applicarsi ai DataSet microbiota. L’abbondanza relativa complessiva di talune specie batteriche possa essere analizzato come possono turni nel microbiota a causa di cambiamenti delle condizioni di habitat. Grafici a barre (Figura 11) e heatmaps (Figura 12) è necessario visualizzare la composizione batterica subgingival phylum livello o a livello di ordine. Vari individui e trattamenti possono essere confrontati in base statistica descrittiva e inferenziale. Figura 13 presenta un confronto istogramma delle due modalità di punta di carta sottogengivale di campionamento a diversi livelli tassonomici. La tabella 1 Mostra il cambiamento nella composizione di biofilm durante uno studio in vitro che confronta due intervalli di tempo (T1 e T3). Variazioni statisticamente significative sono state calcolate con test di Wilcoxon firmare-allinea e seguente correzione di Bonferroni dai dati pyrosequencing 454. Infine, analisi delle Coordinate principali (PCoA) consente a confronto diretto 3D a livello di unità operativa tassonomica (fuori) come identificato in diversi campioni. Le trame di PCoA nella Figura 14 visualizzare differenze intra – e inter – specifico del microbioma subgingival in una serie di caso di cinque figli. Figura 15 Mostra i risultati di uno studio caso-controllo ortodontico: rosa a puntini rossi sono i casi, puntini blu chiaro allo scuro sono i controlli, tutti i campionati più volte nel corso di un periodo di quattro mesi. Un chiaro clustering dei casi dopo l’intervento ortodontico (punti rossi) rappresenta una svolta nel microbioma. Puntini blu, che rappresenta il gruppo di controllo, sono distribuiti uniformemente. Figura 1 : Preparare le punte di carta di lunghezza standardizzata. Punte di carta calibrata sterile sono tagliati alla prima boa anello per standardizzare la loro lunghezza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2 : Carta libera punti dal DNA e sterilizzare. Punte di carta standardizzati sono sterilizzati e UV irradiati in un banco di lavoro pulito. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3 : Inserimento punto carta subgingival. Sono inseriti tangenzialmente sterile calibrata carta punti nel solco subgengivale fino al contrassegno di anello 4 mm per 20 s. Figura 4 : Carta di taglio nel tubo. Direttamente dopo il campionamento, punte di carta vengono tagliati al terzo anello di taratura (4 mm) in una sterile e privo di DNA fiala di 1,5 mL. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5 : Campionamento aggregata e parallelo. Due punti di carta vengono inseriti contemporaneamente nel solco sottogengivale di un dente (A) o di alcuni punti di carta ai solchi sottogengivali di parecchi denti (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6 : Campionamento mucoso. Punte di carta calibrata sterile vengono deposte nella mucosa della piega vestibolare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7 : Raccolta di saliva. In un becher sterile è sputare saliva non stimolata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 8 : Schema di campionamento. I campioni possono essere raccolti come singolo (lato sinistro, un dente ogni), pool (diversi per tutte le strisce in un flaconcino), o campioni di parallelo (strisce blu, due punte di carta a un dente). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 9 : Color-coded deposito. Un codice di colore del rinvio per fogli e fiale facilita ulteriore esempio manipolazione.Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 10 : Analisi di biofilm subgengivale. Presentazione schematica di campionamento clinica biofilm (A), estrazione del DNA (B) e diverse tecnologie NGS (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 11 : Grafico a barre. Mostrando la relativa abbondanza di batteri a livello di phylum analizzati usando pyrosequencing 454. Immagine modificata da Santigli et al. 22 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 12 : Heatmap. Risultati relative abbondanze degli ordini batterici analizzati usando pyrosequencing 454. Rosso scuro rappresenta una relativa abbondanza alta (> 10%). Blu scuro rappresenta un molto basso a nessun abbondanza relativa del rispettivo ordine batterica. Immagine modificata da Santigli et al. 22 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 13 : Istogramma. Confronto tra le due modalità di carta punto di campionamento (modi A e B) a diversi livelli tassonomici. Dati generati con 454-pirosequenziamento. Immagine modificata da Santigli et al. 22 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 14 : 2D PCoA trama. Una serie di casi (n = 5) mostrando differenze inter-individuali e intra-individuale a seguito di due metodi di campionamento sottogengivale (1 colore è 1 soggetto). Dati generati con 454-pirosequenziamento. Immagine modificata da Santigli et al. 22 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 15 : Istantanea di un’animazione 3D della trama PCoA. Visualizzando subgingival microbiome sposta in uno studio caso-controllo ortodontico (n = 16; ogni gruppo, 3 punti in tempo; casi: dal rosa al rossi, controlli: luce blu scuro). Dati generati con 454-pirosequenziamento.Dati non pubblicati dal gruppo di lavoro Santigli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Taxon: immunitŕ Punto nel tempo 1 [%] Punto di tempo 3 [%] Wilcoxon firmare-allinea la prova Phylum/genere 25 Median 75th 25 Median 75th valore di p p-valore registrato n. Altri Altri 0.70 1.07 1.28 1.32 1.63 1.93 .000 .005 Actinobacteria Actinomyces 0.00 0,04 0.13 0,06 0.30 0,97 .001 .021 Rothia 0.00 0.00 0.05 0.00 0.13 0,32 .001 .009 Bacteroidetes Prevotella 0.00 0,01 0.22 0.15 1.02 2,44 .000 .006 Firmicutes Altro (Bacilli) 0.00 0,01 0,06 0.00 0,04 0.10 .706 1.000 Stafilococco 0.00 0,01 0.12 0.00 0.07 0,17 .548 1.000 (Gemellaceae) 0.00 0.00 0.07 0.12 0,77 1.24 .005 .091 (Lactobacillales) 0.00 0.00 0,04 0.00 0.12 1.50 .004 .073 Endocardite 0,09 0.23 0,37 0,64 1.59 2.28 .000 .003 Lactobacillus 0.00 0.00 0.18 0.00 0.00 0,04 .700 1.000 Altro (Streptococcaceae) 0.00 0,04 0.13 0.00 0.10 0,19 .768 1.000 (Streptococcaceae) 0,04 0.10 0.23 0.12 0,37 0,69 .005 .083 Streptococco 53,42 61,96 88,38 48.44 60,83 73,97 .055 .930 Altro (Lachnospiraceae) 0.00 0.00 0,01 0.00 0.00 0,11 .003 .058 Pneumosintes 0.00 0.00 0,04 0.00 0.00 0,04 ,240 1.000 Veillonella 3.43 27,15 42,78 6.69 13,38 27.05 .157 1.000 Proteobacteria Haemophilus 0.00 0.00 0,03 0,31 0.84 2,38 .000 .008 test di Wilcoxon firmare-allinea valore di p # regolata secondo la correzione di Bonferroni Un p < 0,0026 è stato considerato significativo Tabella 1: Analisi statistica. Differenze nel microbioma orale di bambini sani in due punti nel tempo. Dati generati con 454-pirosequenziamento. Immagine modificata da Klug et al. 23

Discussion

Batteri si trovano in tutti i siti all’interno della cavità orale24,25,26. Molti studi si sono concentrati sull’uso di saliva come mezzo di campionamento per mappare la colonizzazione orale come si può facilmente essere provato attraverso sputando27,28,29,30,31, 32. Tuttavia, biofilm salivare non riflette biofilm subgengivale composizione. Così, l’uso di altri metodi di campionamento è cruciale per la creazione di tutta l’immagine e si evoca nuove discussioni nella ricerca dentale. Diversi articoli confrontare l’uso di Curette e punte di carta per il prelievo sottogengivale di soggetti periodontally malate8,33,34. Ancora nessun gruppo di ricerca è noto si sono concentrati sull’applicazione di dispositivi di campionamento standardizzato per diverse fasce di età, soprattutto per i bambini19.

In questo video, campionamento di biofilm orali di tre habitat orale nei bambini sani è presentato.

Le modifiche e la risoluzione dei problemi:

L’obiettivo del manoscritto si concentra sul protocollo clinico per il campionamento di biofilm subgengivale di bambini sani. Il metodo di scelta si riferisce al suoni sulci subgingival dove lo spazio limitato rende particolarmente impegnativo di campionamento. In questo video il metodo è stato applicato alla precoce dentizione permanente. Può anche essere applicato alla dentizione mista o matura e a bambini e adulti. Il nostro metodo di campionamento consente di effettuare modifiche ad esempio campioni singoli o pooled. Quest’ultimo potrebbe diventare un fattore cruciale per analisi molecolari a causa della piccola quantità di DNA da collezione dal solco subgengivale sano. La scelta dei denti indice può essere modificata su richiesta; in particolare, un altro dente può essere campionate in alternativa quando l’epitelio è traumatizzata e sanguinamento, rendendo così il punto di carta inutilizzabile. Campionamento parallelo utilizzando due punti di carta contemporaneamente in un unico sito rende campione replicati in un unico passaggio, oltre ad abbreviare i tempi di sedia per bambini.

Con lievi modifiche si possono campionare malate tasche parodontali. Qui punte di carta dovrà essere inserito per l’intera lunghezza della tasca, che può raggiungere fino a 10 mm. La lunghezza e il cono di punte di carta così come la profondità di inserimento deve essere adattato all’habitat intraoral di interesse, ma dovrebbe sempre essere standardizzata di materiale e dimensioni. Campioni possono essere prelevati anche dalla mucosa usando punte di carta. Protocolli identici consentono comparazioni di diversi habitat orale e vari materiali dentali. Preparazione del paziente e conservazione dei campioni può essere eseguite come descritto in questo video. Per la ricerca di metatranscriptome, RNA potrebbe essere campionato con lo stesso metodo. Così, dopo il campionamento, i punti di carta devono essere inseriti direttamente nella soluzione di stabilizzazione di RNA.

Limiti della tecnica:

Indipendentemente dalle modifiche, il metodo di campionamento clinica che descriviamo è limitato a solco subgengivale suono. Altri siti di campionamento, per quanto riguarda tasche periodontally malate di esempio, non facevano parte del nostro studio di design. Come campionamento per tutta la profondità di queste tasche è necessaria, punte di carta potrebbero non essere abbastanza grande per raccogliere campioni sufficientemente. Se l’obiettivo sperimentale è quello di confrontare i dati acquisiti dal suoni subgingival solchi e tasche periodontally malate, è importante da tenere presente il pregiudizio inerente che è associato con metodi di campionamento clinici differenti. Non è pertanto consigliabile confrontare tali dati.

Una limitazione del metodo qui presentato è campionamento senza l’uso successivo di propidio monoazide. L’aggiunta di questo agente direttamente dopo il campionamento consente un’analisi specifica delle cellule viventi solo nel biofilm analizzati. Il metodo di campionamento descritto qui riflette il numero di cellule vive e morte. Per la ricerca di periodontitis severo, punte di carta probabilmente bisogno essere sostituito da curette, come formazione di biofilm in tasche profonde è forte. Punto di campionamento potrebbe non riflettere l’intero spettro microbico in questi casi, come la loro superficie della carta potrebbe essere saturo troppo in fretta.

Significato per quanto riguarda i metodi esistenti:

Il manoscritto proposto è il primo del suo genere per standardizzare subgingival campionamento nel solco sano con punte di carta. Altri rapporti hanno fatto riferimento all’uso del metallo Curette35,36 o carta punti 37,38,39, ma non ha descritto i processi che si svolgono prima del campionamento, tali come controllo della placca, denti pulizia, isolamento del dente e asciugatura, così come i processi che derivano da specifiche inadeguate su linee di tecnica e tempo di campionamento.

In due articoli precedenti, indichiamo che l’uso di punte di carta è un metodo riproducibile per il campionamento di biofilm subgengivale in bambini22,40. Grazie al loro design, Curette sono troppo grandi per il solco poco profondo con spazio limitato e troppo forte per l’epitelio giunzionale tenera. È fondamentale accedere il solco subgengivale senza traumatizzare l’epitelio. In questo modo, si evita pregiudizi derivanti da sanguinamento. Così, l’uso dei punti di carta sottile e tenera è preferito per questa zona. Punte di carta sono funzionali per monitorare i cambiamenti nella composizione di biofilm durante il trattamento ortodontico21,41. Sono sottile e sufficientemente flessibile per adattarsi tra gli elementi di apparecchi ortodontici fissi. Questo è un grande vantaggio ad altri metodi di campionamento come Curette. Atraumatic campionamento è semplificata e campionamento di piccole quantità di DNA è possibile.

Future applicazioni:

In questo video abbiamo dimostrato il metodo sulla dentatura non malate, precoce, permanente. Può essere applicato anche alla dentizione mista o matura. Con alcuni adattamenti è possibile assaggiare periodontally malate siti come i denti o gli impianti e altre nicchie a causa di materiali dentali seguendo lo stesso protocollo. Ricerca della carie potrebbe beneficiare di questo protocollo standardizzato, in particolare studi sulla carie della radice. La lezione più importante dalla nostra campionatura dei video è la standardizzazione dei protocolli per rendere i dati comparabili, non importa che cosa e come campioni sono misurati.Dimostrazioni video future potrebbero migliorare il campo di campionamento clinico in generale.

Biofilm orali ottenute come mostrato nel video è utilizzato nelle cliniche e per le indagini scientifiche. Questo approccio in vivo rappresenta una buona aggiunta in vitro tecniche molecolari come l’ibridazione in situ di fluorescenza e microscopia15di scansione laser confocale. Metodi NGS, come il pirosequenziamento riportato di seguito, applicato a biofilm raccolti, permettono l’analisi del microbiota completo. Calcolare l’abbondanza relativa di determinate specie batteriche può essere utilizzato per sostenere i trattamenti o per confrontare diversi pazienti o trattamenti diversi. Insieme a un workflow di analisi protocollo e sequenza di sequenziamento standardizzati che abbiamo precedentemente descritto40, questo metodo di campionamento permette l’analisi di sequenza fino al livello di genere. Maggiori “meta”-studi come metatranscriptomic o metabolomico studi sono possibili basano sul protocollo di campionamento presentato in questo video.

Fasi critiche:

Evitando la contaminazione è un passaggio fondamentale: strumenti sterili devono essere applicate in un ambiente non sterile in vivo . Il trasferimento dalla bocca al banco deve essere effettuata rapidamente e in modo sicuro da un esaminatore esperto per mantenere la durata della seduta per i partecipanti di studio più brevi possibile. La fase più critica nel protocollo è l’inserimento atraumatico del punto di carta dentro il solco subgengivale. Rottura dell’epitelio giunzionale e sanguinamento assolutamente devono essere evitate. Ulteriore cura deve essere presa al fine di non contaminare carta punti e stoccaggio fiale con RNA o DNA esogeno. Il deposito quindi è anche un passo fondamentale. I campioni devono essere congelati direttamente, nella migliore delle ipotesi a − 80 ° C. Questo evita modifiche nel campionamento post composizione batterica, che falsificherebbe risultati di sequenziamento.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori sono grati a Joachim Theussl (centro di ricerca medica, Università medica di Graz) per l’eccellente assistenza tecnica nella produzione video e a Monica Farrell (gestione di ricerca, Università medica di Graz) come talento vocale.

Materials

Paper Points Taper .02, sterilised VDW Dental 550 029 015 http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&cHash=
1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2
GC Cocoa Butter, Tube of 10 g GC EUROPE N.V. 000387 http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22
Rondells blue DIRECTA AB Rondell Tablets http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767
Great Lakes Nola Dry Field System Great Lakes Ortho 300-401 http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626
tooth brush Oral-B http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro
micro-Ident plus11 Hain Lifescience GmbH 23312 http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html
ParoCheck Greiner Bio One International GmbH 460020 https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/
Carpegen Perio Diagnostik Carpegen GmbH http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html
tubes Reaktionsgefäße 1,5 ml Lactan CH77.1  to CH81.1 www.lactan
cotton swabs Henry Schein 9003182 www.henryschein.at
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References

  1. Paster, B., et al. Bacterial Diversity in Human Subgingival Plaque. J Bacteriol. 183 (12), 3770-3783 (2001).
  2. Aas, J., Paster, B., Stokes, L., Olsen, I., Dewhirst, F. Defining the Normal Bacterial Flora of the Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43 (11), 5721-5732 (2005).
  3. Ledder, R., et al. Molecular Analysis of the Subgingival Microbiota in Health and Disease. Appl Environ Microb. 73 (2), 516-523 (2007).
  4. Zaura, E., Keijser, B., Huse, S., Crielaard, W. Defining the healthy ‘core microbiome’ of oral microbial communities. BMC Microbiol. 9 (259), 1-12 (2009).
  5. Alcaraz, L. D., et al. Identifying a healthy oral microbiome through metagenomics. Clin Microbiol Infec. 18 (11), 54-57 (2012).
  6. Dewhirst, F., et al. The Human Oral Microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
  7. Keijser, B. J. F., et al. Pyrosequencing analysis of the Oral Microflora of healthy adults. Journal of Dental Research. 87, 1016-1020 (2008).
  8. Könönen, E., Müller, H. Microbiology of aggressive periodontitis. Periodontol 2000. 65 (1), 46-78 (2014).
  9. Nasidze, I., Li, J., Quinque, D., Tang, K., Stoneking, M. Global diversity in the human salivary microbiome. Biotechfor. 19 (4), 636-643 (2009).
  10. Jervøe-Storm, P. M., Koltzscher, M., Falk, W., Dörfler, A., Jepsen, S. Comparison of culture and real-time PCR for detection and quantification of five putative periopathogenic bacteria in subgingival plaque samples. J Clin Periodontol. 32 (7), 778-783 (2005).
  11. Ouhara, K., et al. Susceptibilities of periopathogenic and cariogenic bacteria to antibacterial peptides, β-defensins and LL37, produced by human epithelial cells. J Antimicrob Chemoth. 55, 888-896 (2005).
  12. Belda-Ferre, P., et al. The oral metagenome in health and disease. ISME J. 6 (1), 46-56 (2011).
  13. Holt, S., Ebersole, J. Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, and Tannerella forsythia: the ‘red complex’, a prototype polybacterial pathogenic consortium in periodontitis. Periodontol 2000. 38, 72-122 (2005).
  14. Gomez, A., Nelson, K. The Oral Microbiome of Children: Development, Disease, and Implications Beyond Oral Health. Microb Ecol. 73 (2), 492-503 (2017).
  15. Klug, B., et al. Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy. J Vis Exp. , e2967 (2011).
  16. Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. J Vis Exp. , (2016).
  17. Kilian, M., et al. The oral microbiome – an update for oral healthcare professionals. British Dental Journal. 221 (10), 657-666 (2016).
  18. Razzouk, S., Termechi, O. Host genome, epigenome, and oral microbiome interactions: toward personalized periodontal therapy. J Periodontol. 84 (9), 1266-1271 (2012).
  19. De Freitas, A., Marquezan, M., da Nojima, M., Alviano, D., Maia, L. The influence of orthodontic fixed appliances on the oral microbiota: A systematic review. Dent Press J Orthod. 19 (2), 46-55 (2014).
  20. Akin, M., Tezcan, M., Ileri, Z., Ayhan, F. Incidence of white spot lesions among patients treated with self- and conventional ligation systems. Clin Oral Invest. 19 (6), 1501-1506 (2015).
  21. Ren, Y., Jongsma, M., Mei, L., van der Mei, H., Busscher, H. Orthodontic treatment with fixed appliances and biofilm formation-a potential public health threat?. Clin Oral Invest. 18 (7), 1711-1718 (2014).
  22. Santigli, E., Trajanoski, S., Eberhard, K., Klug, B. Sampling Modification Effects in the Subgingival Microbiome Profile of Healthy Children. Frontiers Microbiol. 7, 2142 (2017).
  23. Klug, B., et al. From Mouth to Model: Combining in vivo and in vitro Oral Biofilm Growth. Frontiers Microbiol. 7, 1448 (2016).
  24. Ximénez-Fyvie, L., Haffajee, A., Socransky, S. Microbial composition of supra- and subgingival plaque in subjects with adult periodontitis. J Clin Periodontol. 27 (10), 722-732 (2000).
  25. Zijnge, V., et al. Oral Biofilm Architecture on Natural Teeth. PLoS ONE. 5 (2), e9321 (2010).
  26. Diaz, P. I., et al. Using high throughput sequencing to explore the biodiversity in oral bacterial communities. Mol Oral Microbiol. 27 (3), 182-201 (2012).
  27. Goode, M., Cheong, S., Li, N., Ray, W., Bartlett, C. Collection and extraction of saliva DNA for next generation sequencing. J Vis Exp. , (2014).
  28. Hodgson, N., Granger, D. Collecting saliva and measuring salivary cortisol and alpha-amylase in frail community residing older adults via family caregivers. J Vis Exp. , e50815 (2013).
  29. Luo, A. H., Yang, D. Q., Xin, B. C., Paster , B. J., Qin, J. Microbial profiles in saliva from children with and without caries in mixed dentition. Oral Dis. 18 (6), 595-601 (2012).
  30. Nasidze, I., et al. Comparative analysis of human saliva microbiome diversity by barcoded pyrosequencing and cloning approaches. Anal Biochem. 391 (1), 64-68 (2009).
  31. Pfaffe, T., Cooper-White, J., Beyerlein, P., Kostner, K., Punyadeera, C. Diagnostic Potential of Saliva: Current State and Future Applications. Clin Chem. 57 (5), 675-687 (2011).
  32. Zhu, W., Gallo, R., Huang, C. M. Sampling human indigenous saliva peptidome using a lollipop-like ultrafiltration probe: simplify and enhance peptide detection for clinical mass spectrometry. J Vis Exp. , e4108 (2012).
  33. Belibasakis, G., Schmidlin, P., Sahrmann, P. Molecular microbiological evaluation of subgingival biofilm sampling by paper point and curette. Apmis. 122 (4), 347-352 (2014).
  34. Hayashi, F., Okada, M., Soda, Y., Miura, K., Kozai, K. Subgingival distribution of Campylobacter rectus and Tannerella forsythensis in healthy children with primary dentition. Arch Oral Biol. 51 (1), 10-14 (2006).
  35. Papaioannou, W., et al. The microbiota on different oral surfaces in healthy children. Oral Microbiol Immunol. 24 (3), 183-189 (2009).
  36. Abusleme, L., et al. The subgingival microbiome in health and periodontitis and its relationship with community biomass and inflammation. ISME J. 7 (5), 1016-1025 (2013).
  37. Griffen, A., et al. Distinct and complex bacterial profiles in human periodontitis and health revealed by 16S pyrosequencing. ISME J. 6 (6), 1176-1185 (2011).
  38. Jünemann, S., et al. Bacterial Community Shift in Treated Periodontitis Patients Revealed by Ion Torrent 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing. PLoS ONE. 7 (8), e41606 (2012).
  39. Cortelli, J., et al. Detection of periodontal pathogens in newborns and children with mixed dentition. European J Clin Microbiol Infect Dis. 31, 1041-1050 (2012).
  40. Trajanoski, S., et al. Next-generation sequencing in microbiome analysis: factors affecting reproducibility of repeated biofilm sampling of the gingival sulcus of children. JDOCE. 1 (3), 34-46 (2013).
  41. Jongsma, M., et al. Biofilm formation on stainless steel and gold wires for bonded retainers in vitro and in vivo and their susceptibility to oral antimicrobials. Clin Oral Invest. 17 (4), 1209-1218 (2013).

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Santigli, E., Koller, M., Klug, B. Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children. J. Vis. Exp. (130), e56320, doi:10.3791/56320 (2017).
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