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신경과학

영상 모니터 세포 생물학과 여러 신경 인구의 계보 진행을 추적 하는 단일 셀 다음 라이브

Published: December 16, 2017
doi:
10.3791/56291
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1Biochemistry and Molecular Biology Department, Faculty of Veterinary medicine,Complutense University, 2University Institute for Neurochemistry Research (IUIN), 3Instituto de Investigación Sanitaria del Hospital Clínico San Carlos (IdISSC), 4Institute of Stem Cell Research, Helmholtz Center Munich, Neuherberg/Munich, Germany Physiological Genomics, Biomedical Center,Ludwig-Maximilians University Munich, 5Toxicology and Pharmacology Department, Faculty of Veterinary medicine,Complutense University, 6Brain Institute,Federal University of Rio Grande do Norte, 7Department of Biosystems Science and Engineering,Eidgenössische Technische Hochschule (ETH) Zurich

Summary

뒤에 소프트웨어 기반 후 처리 시간 경과 비디오 현미경에 의해 신경 인구를 모니터링 하는 강력한 프로토콜 설명 되어 있습니다. 이 메서드는 선택 된 인구 라이브 이미징 실험 동안에 생물 학적 이벤트를 식별 하는 강력한 도구를 나타냅니다.

Abstract

신경 세포 인구, 확산, 감 별 법, 세포 운명 결정 등의 중요 한 생물 학적 이벤트를 제어 하는 메커니즘을 이해 하는 신 경계에 영향을 미치는 많은 질병에 대 한 디자인 치료 전략에 중요 한 될 것입니다. 스틸 이미지에서 그들의 최종 결과에 의존 하는 현재 방법 세포 인구를 추적 하 고 그들은 일반적으로 단일 셀에 행동 기능을 식별 하기 위해 충분 한 시간 해상도 제공 하지. 또한, 세포 죽음에 있는 변이, 셀 인구, 희석, 확산, 또는 세포를 분석 하는 데 사용 하는 마커의 낮은 효율 행동이 결과의 불완전 하거나 잘못 된 지요 이어질 것입니다 모든 중요 한 장애는. 반대로, 라이브 이미징 및 적절 한 조건 하에서 추적 하는 단일 셀 수행 각 이러한 이벤트를 모니터링 하는 강력한 도구를 나타냅니다. 여기, 다음 후 처리 시간 경과 비디오 현미경 검사 법 프로토콜, 특정 소프트웨어를 사용 하는 단일 셀 해상도, 신경 인구 추적을 설명 합니다. 설명 하는 방법 연구자 뚜렷한 신경 인구의 세포 생물학과 혈통 진행에 관한 근본적인 질문을 해결 하기 위해 사용 합니다.

Introduction

신경 인구 재생성을 더 효과적인 치료 전략을 개발 하기 위해서는 우리가 먼저 재생 잠재력에 신경 세포를 유지 하는 기본 메커니즘을 이해 해야 합니다. 이 목표를 추구 하는 정지, 확산/감 별 법, 모드, 세포 주기 길이, 철새 용량, 생존, 등등의 타이밍 사이의 균형을 조절 하는 요인의 포괄적인 지식이 필요 합니다. 비록 그것은 많은 년1에 대 한 고용은 기술적인 접근, 라이브 영상 하 고 직접 관찰은 위에 나열 된 이벤트를 모니터링 하는 데 최고의 옵션에 여전히 남아 있다. 다른 많은 접근 끝점 정보를 중심으로, 반대로 이미징 생활과는 실험2,3,,45, 의 길이 걸쳐 정보를 제공 하는 단일 셀 추적 6. 따라서, 주목 시간적 해상도의 추가 세포 죽음, 이종 세포 행동, 또는 세포 운명 결정 수 있습니다, 뿐만 아니라 많은 다른 중요 한 이벤트를 식별할 수를 다르게 전달할 수 있습니다. 이상적으로, 이러한 기능은 셀의 최고의 모니터링 해야는 단일 세포 수준의 vivo에서 에서 어디 두 기본 (셀 자치)와 외부 (셀 틈새) 신호는 고려.

그러나, 생체 외에서 상황 이벤트 자연 환경 재현 하지 않는 환경에서 발생, 저밀도 문화 일반적으로 이러한 프로토콜에 사용 조건이의 본질적인 특성을 더 적당 한는 셀입니다. 또한, 단순히 성장 매체를 수정 하 여 주변 환경과의 더 단순한 제어 각 신경 틈새를 정의 하는 외적 요소 뿐만 아니라 수 있는 환경 요인의 개별 역할을 조사 하는 유용한 도구를 구성 수 있습니다. 병 적인 시나리오7,8,9,10,11,,1213에 유도 될. 따라서, 여기에 제안 된 프로토콜에서 올바르게 구성 된 경우 라이브 이미징 이전 열거 하는 질문의 대부분을 해결 하기 위해 가능한 생체 외에서 솔루션 제공.

간단히,이 프로토콜에는 하드웨어, 소프트웨어, 문화 조건, 그리고 단일 셀 추적 다음 라이브 이미징 실험을 성공적으로 수행 하는 데 필요한 주요 단계 설명 합니다. 이 방법은 여러 신경 인구의 계보 진행, 생물학의 기본적인 측면을 공개 하는 데 도움이 귀중 한 정보를 제공 합니다.

Protocol

다음 섹션에서는 라이브 이미징 여러 신경 인구 (그림 1)의 단일 셀 추적 하 여 다음을 수행 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 관련 된 동물 이어야 하는 모든 절차 실험실 동물 과학 (ICLAS)에 대 한 국제 위원회의 지침에 따라 실시. 그림 1. 절차, 즉의 주요 실험 단계를 설명 하는 체계: 세포 문화, 라이브 영상, PICC 및 데이터 수집, 추적, 단일 셀 및 최종 결과. 단계는 프로토콜의 작업 흐름에 따라 번호가 매겨집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 1. 세포 배양: 고립과 신경 인구 또는 세포 계보의 선택 된 도금 참고:이 프로토콜 함께, 뚜렷한 세포 인구에의 응용의 예 신경 세포의 생물학을 분석 하는 유틸리티를 확인 하기 위해 제공 됩니다. 이러한 포함: 성인 신경 줄기 세포 (aNSCs) (대 한 자세한 격리 프로토콜 참조14); 마우스 SubEpendymal 지역 (SEZ)에서 파생 된 (자세한 격리 프로토콜 참조15);에 대 한 신경 프로그래밍 공부 하 산 후 피 질 이다 (자세한 격리 방법 참조16);에 대 한 출생 후 소 뇌 이다 그리고 마우스 신경-2a 신경 세포 선 (N2a). 폴 리-D-리에 씨 직접 셀 24-잘 접시 코팅. 문화 매체의 1 mL를 사용 하 여 잘 당. 37 ° C 및 8% CO2 aNSCs, 또는 라이브 이미징 이전 2 h의 이다/셀 라인에 대 한 37 ° C, 5% CO2 접시를 품 어. 단일 셀 추적 unfeasible 만드는 자동화 된 현미경 단계 난민으로 원치 않는 움직임을 방지 하기 위해 coverslips 사용을 하지 않습니다.참고: 셀 밀도 문화 미디어 실험에는: Dulbecco에 aNSCs에 대 한 30-40, 000 셀/잘의이 글의 중간 (DMEM:F12 영양소 혼합 매체);를 수정 N2a 셀 DMEM 높은 포도 당 매체에 대 한 20000 셀/잘, 80000 셀/잘 소 뇌 이다 DMEM 높은 포도 당 매체; 그리고 55-65, 000 셀/잘 DMEM:F12 영양소 혼합 매체에 산 후 이다. 가능 셀의 낮은 수에 문화 세포 밀도 조정 하 여 문화 프로토콜을 표준화. 그럼에도 불구 하 고, 셀 밀도 문화의 생존 능력을 유지 하기 위해 충분히 높은 해야 합니다.참고: 셀 밀도 너무 높은 경우, 초과 파편 또는 가난한 분리 (덩어리) 수 있습니다 방해 단일 셀의 추적. 2. 시간 경과 비디오 현미경 검사 법에 의해 Imaging 라이브 현미경, 카메라, 하드웨어, 그리고 보육 시스템을 켭니다. 온도 설정 하 고 37 ° C, 8% CO2 aNSCs, 또는 이다/셀 라인에 대 한 37 ° C, 5% CO2 압력 공기. 허용 온도 CO2 레벨 1-2 h에 대 한 안정.참고: 특정 장비 하는 데 필요한 시간 경과 비디오 분석을 수행을 포함 한: 밝은 분야/위상 대비/형광 현미경 동력 부품; 온도, CO2 습도; 제어 하는 외피 장치 그리고 마지막으로, 안정적이 고 충분히 강력한 하드웨어 및 소프트웨어를 취득 하 고 그림의 볼륨 처리 년도 라이브 이미징 실험 (제발 테이블의 자료확인). 일단 셀 접시 (2 h 도금 후)에 단단히 연결 되어, 영구 마커 펜을 사용 하 여 추적, 즉, 셀을 포함 하지 않는 잘 사용 되지 것입니다 한 우물의 바닥에 작은 마크를 만들기 위해.참고:이 마크 것 이다 참조로 사용할 수 있는 xyz 좌표를 0으로 하 고 동안 또는 실험 후 또는 제로 위치에 반환에 매체의 변화 사이 언제 든 지 사용할 수 있습니다. 현미경의 인큐베이션 챔버 내부 접시를 놓고 단단히 단계 동안을 피하기 위해 어떤 원치 않는 움직임 현미경의 전동된 스테이지의 변위에 접시를 첨부 합니다. 약 20 분 동안 상공에 equilibrate 셀 문화 매체의 온도 허용 합니다. 이 단계는 부품의 팽창으로 인해 녹음 중 초점의 손실을 피할 것입니다. 라이브 이미징 소프트웨어를 시작 하 고 실험을 설정 하려면 시간 경과 모듈을 선택 합니다. “시간-일정 탭 메뉴”에서 실험 및 이미지 수집 주기의 총 기간을 설정 합니다. 전송의 고유의 phototoxicity 또는 사용 하는 형광 빛 분석의 시간적 해상도 잠재적인 세포의 죽음 사이의 균형을 적절 한 간격을 정의 합니다.참고: 예를 들어 120 h의 총은 대물 사진 마다 5 분이이 구성에서는 단일 동영상의 120 h의 인수 120-150 기가바이트의 무료 저장 공간이 컴퓨터 장치에 필요 합니다 고려 인수 aNSC 문화에 선정 됐다. X 및 y 좌표, 및 초점 거리 (z 좌표)는 “xyz 포인트 탭 메뉴”에 의해 정의 된 이미지 위치를 선택 합니다. 언제 든 지 좌표를 검색 하기 위해 초기 위치 참조점 (xyz 제로 좌표)를 포함 합니다. 또는 epifluorescence 여기 필요할 때에 수집 “파장 선택 탭 메뉴에서”, 관찰법의 종류를 선택 합니다. 노출 시간을 선택 합니다. 전송, 노출 그를 명심 하 고 특히 형광 빛 (위에 표시)으로 세포 생존 능력 손상 수 있습니다. ANSCs, 소 뇌 이다, N2a 셀에 대 한 명시 (10-50 ms 노출 시간)를 선택 합니다. 불리고 외피 이다 빨강/녹색 형광을 조합에서 명시 (10-50 ms 노출 시간)를 선택, 실험을 위해 사용 하는 기자의 따라 (빨간색 여기 파장: 550 nm와 400 ms 노출 시간; 녹색 여기 파장: 460-500 nm 및 100 ms 노출 시간). 실험 및 이미지 저장 될 폴더의 이름을 정의 합니다. 언제 든 지 실험을 다시 로드 하는 위치의 목록을 저장 하 고 모든 조건을 설정한 후 “지금 실행” 버튼을 클릭 하 여 실험을 실행. 실험을 일시 중지 하 고 다시 실험 완료 될 때까지 하루에 한 번씩 “덮어쓰기 z 버튼”을 클릭 하면 초점 상태를 조정 합니다. 변화는 매체에서 라이브 영상 중 필요한 경우, 실험을 일시 중지 하 고 시간 경과 상공에서 접시를 검색 합니다.다음, 무 균 조건 하에서 매체를 변경 하 고 무대에 다시 플레이트를 배치 (단계 2.3 참조). 다시 초점 상태를 조정 하 고 실험을 다시 시작.참고: 세포 죽음 또는 이상의 확산, 매체의 pH의 변화 뿐만 아니라, 실내 온도에 변화 수에 영향을 세포에 현미경의 초점을 맞추고 올바른. (예: aNSCs) 중요 한 문화에 대 한 우리 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES) 보충 하는 매체의 사용을 권장 (최종 농도: 1 m m). 3. 후 이미징 Immunocytochemistry (PICC), 데이터 수집 및 처리 실험 완료 되 면 소프트웨어를 일시 중지 하 고 단계에 설명 된 대로 고정 및 PICC, 접시를 검색 합니다. 셀 고정을 수행: 셀 1 mL 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)을 한 번 씻어 고 추가 500 µ L의 paraformaldehyde (PFA) (PBS에 4%), 실 온 (RT)에서 10 분을 배양.주의: Paraformaldehyde 강한 정착 제 이며, 피부 또는 눈 접촉을 피하기 위해 신중 하 게 처리 해야 합니다. 그것은 증기 두건 안쪽 에서만 조작할 수 있어야 합니다. 셀 1 mL의 PBS로 3 회 세척 하 고 차단 솔루션 (PBS 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 2% (wt/vol)와 0.2% (vol/vol) 비 이온 계면 활성 제를 포함)의 500 µ L을 추가. 실시간에서 1 시간을 품 어 차단 솔루션을 제거 하 고 기본 항 체 솔루션의 250-400 µ L를 추가 합니다. 실시간에서 2 h을 품 어 1 차 항 체 해결책 BSA의 2% (wt/vol)와 0.2% (vol/vol) 비 이온 계면 활성 제를 포함 하는 PBS에 희석 하는 주 항 체를 포함 한다. 여기서 설명 하는 실험에 사용 되는 항 체: GFAP (1: 500), βIII-tubulin (1:1, 000)와 α-tubulin (1:1, 000). 이 우물에서 직접 실시는, 해결책의 더 큰 볼륨은 필요한 모든 셀 커버 (250-400 µ L). 1 mL의 PBS로 3 회 세척 하 고 2 차 항 체 솔루션 (3.4 단계에서 설명한 대로 희석)의 250-400 µ L을 추가. 여기서 설명 하는 실험에 사용 된 이차 항 체: 항 마우스 Fluorescein (FITC) (1:800), 반대로 토끼 Cy3 (1: 500). 어둠 속에서 1 h RT에 품 어. PBS의 1 mL에 세 번 씻어. 프로토콜의 후속 단계에 대 한 PBS의 1 mL에 셀을 계속. 현미경 스테이지에 다시 접시를 놓고 무대 전동된 현미경 무대의 변위 중 원치 않는 움직임을 방지에 단단히 연결 합니다. 2.2 단계에서 만든 표를 사용 하 여 제로 위치는 xyz를 검색 하 고 다시 “모든 X, Y, Z 오프셋” 버튼을 눌러이 참조 지점에 위치를 설정 합니다. 다시 각 위치에 대 한 초점 거리를 설정 합니다. 취득 “파장 선택 탭 메뉴”에서 형광 방출에 필요한 조건을 구성 하는 이미지의 최종 라운드는 PICC에 이전 대상으로 항 원 검출 하기 위하여. 간단히, 이외에 명시, FITC 활성화 (여기: 495 nm) 및 Cy3 (여기: 550 nm) 소프트웨어에 인수 옵션. 대물 400 ms 노출에 대 한 10-50 ms를 사용 하 여 감지 하는 fluorophores 고 사진의 최종 라운드를 얻으려고 “1 시간 루프” 버튼을 누르면.참고: 형광의 강도 PICC 결과 따라 달라질 수 있습니다. 최적의 이미지 품질을 얻으려면 박람회 시간을 조정 합니다. 소프트웨어의 파일/내보내기 옵션을 선택 하 고 미리 정의 된 대상 폴더에 태그 이미지 파일 형식 (Tiff) 또는 공동 사진 전문가 그룹 형식 (Jpeg)에 그림을 내보냅니다. 추적 소프트웨어에 필요한 형식으로 내보낸 이미지를 변환: 추적 도구17 (tTt). 이 위해 입력을 정의 하 고 출력 폴더 위치 (xy), 채널 (c), 및 시간-점 (t), 사용 하는 표식으로 창 운영 “tTt 변환기 도구”에서 “이미지 변환” 버튼을 누릅니다.참고: 이미지가 특정 설정에 따라 이름을 바꿀 수 그리고 그들은 실험에 사용 된 각 위치에 대 한 개별 폴더에 저장 해야 합니다. 설치, 요구 사항에 대 한 지침에서 다운로드할 수 있습니다 위치/이미지 및 추적 도구를 사용 하 여 이름 바꾸기: https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/tTt-and-qtfy.html. 4. 단일 셀 추적 데이터를 이름을 바꾼 후 tTt 소프트웨어를 실행 합니다. 사용자 이름 및 tTt 작업 폴더를 선택 합니다.참고: 추적 도구 작업 폴더는 모든 분석된 데이터와 내보낸된 결과 개최 한다. 작업 폴더 tTtexport, “AVIexport”, “구성”, “TreeExport”, 및 “tTtfiles” 이라는 하위 폴더를 포함 하 이름을 지정 해야 합니다. 로드 “선택 실험 폴더 창에서” 실험 저장 폴더 경로 나타내는 실험을 선택 하 고 “실험 로드” 버튼을 클릭 합니다. 로드 이미지 추적 소프트웨어에 의해 읽을 수 있는 형식으로 변환 하는 데 로그 파일 변환기를 실행 (처음으로 로드 하는 실험에 대 한이 요청 됩니다 자동으로 소프트웨어에 의해). (후 변환, 실험 기간 동안 기록 하는 위치에 대 한 개요 “위치 레이아웃 창”에 표시 됩니다)의 기호를 클릭 하 여 추적에 대 한 위치를 선택 합니다. 각 위치와 해당 번호의 그림에는 기호에 의해 표현 됩니다 ( 그림 1참조). 일단 위치를 선택 하 고 사용할 수 있는 이미지의 목록 “위치 레이아웃 창”의 오른쪽에 표시 됩니다, 그들을 선택 하 고 “로드 이미지” 버튼을 클릭 합니다. 일단 로드가 완료 되 고 “셀 편집기 창” 표시, 파장 및 이미지 간격 “셀 편집기 창”에서 추적을 선택 합니다. 명시에 해당 하는 파장 0, FITC, Cy3, 2에 해당 하는 1와 DAPI 3. 여기에 설명 된 실험에서 간격 1이 사용 된, 즉, 모든 이미지 로드. 명확히 하기 위해, 간격 2 모든 두 번째 이미지의 로딩을 의미 합니다. 일단 이미지 로드 “위치 레이아웃 창”으로 다시 이동 하 고 이전에 로드 된 위치를 나타내는 아이콘을 두 번 클릭. “영화 창” 단일 셀 추적을 수행할 수 있도록 표시 됩니다. 추적 도구 지침에 따라 추적을 진행 합니다. (명시에 해당), 0 채널을 선택 하 고 (“조정 감마 버튼”) 명암과 밝기를 조정. F2 키를 눌러 추적을 시작 합니다.참고: 추적, 중 추적된 셀 것 뒤에 그것에 마우스 포인터를 배치 하 고 “0” 키를 누르면. 세포 분열, 세포 apoptosis 및 손실된 셀 단추 이러한 특정 셀 이벤트를 모니터링할 수 있습니다.실험, 추적으로 이러한 각각의이 옵션 자동으로 추적 되 고 실험으로 “셀 편집기 창”에서 그려진 계보 나무에 보여질 것입니다. 일단 복제 추적 PICC 셀 자손의 성격을 파악 하 여 면역 형광 이미지 대물 사진을 일치. 각 epifluorescence 채널 “영화 창”에 표시 됩니다 (채널 1, 2, 등). 5. 최종 결과 일단 단일 셀 추적을 완료 하 고 확인, 자손 저장 실험 (셀 편집기 창/파일 탭으로 현재 트리를 저장 /) 결과 수출 하 고 이동. 계보 나무와 “셀 편집기 창”에 있는 “내보내기 메뉴”에서 셀 데이터를 내보냅니다. 마찬가지로 내보낼 셀 이미지와 영화 “내보내기 메뉴”를 통해 “영화 창”을 통해 액세스할 수. 이미지, 계보 나무, 데이터, 및 영화 tTt 작업 폴더로 내보내집니다.

Representative Results

설명 하는 방법을 확인할 수를 여러 신경 인구의 세포 생물학에 관한 중요 한 질문을 수 있습니다. 예를 들어, 그것은 aNSCs7,8,,1418neurogenic 및 oligodendrogliogenic 계보의 진행을 모니터링할 수 있었습니다. 단일 aNSCs 및 그들의 자손 (그림 2A, B), 그 aNSCs을 보여 수를 추적 하 여 고립 된 생체 외에서 주로 생성 하는 neuroblasts, 그들의 neurogenic 자연 유지 하 고 에 제안 된 그들은 순서를 따라 vivo19 이전 단일 세포 수준에서 설명 하지만. 또한,이 문화 시스템 허용 NSC 자체 갱신8,14를 공부 하는 독특한 모델을 제공 하 세 즈 (그림 2B)에서 aNSC 혈통에 처음으로 시각을 비대칭 세포 분열. 마찬가지로, 그리고 분석, 혈통에 관계 없이 세포 성장, 부문, 세포 생존 능력, 또는 세포 주기 길이의 라운드에 관한 귀중 한 데이터를 얻을 수 있었습니다. 그림 2. ANSCs의 예는 SEZ에서 격리 하 고 라이브 이미징 및 단일 셀 추적 하 여 분석. 단계 대조 이미지 다른 시간 점 (하루-높이: 분)에서 복제의 진행 묘사. ΒIII-tubulin (녹색) 및 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 블루) 최종 이미지 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP, 레드)에 대 한 게시물 영상 immunocytochemistry (PICC)에 해당합니다. (A) 분석 부문 증폭의 다른 라운드 통해 대칭 neurogenic 나무 포스트 mitotic neuroblasts 생성 하. 빨간색 화살표 대칭 나무에 포함 된 셀을 가리킵니다. 오른쪽에 해당 하는 클론과 tTt 소프트웨어에 의해 생성 된 계보 나무 표시 됩니다. 잠재적인 자기 갱신 이벤트를 통해 고요한 GFAP 긍정적인 세포 다른 제공 상승 하면서 neuroblasts를 생산 하기 위해 증폭 사단을 겪고 한 분기와 비대칭 neurogenic 트리를 생성 하는 뿌리의 (B) 예. 오른쪽, tTt 소프트웨어에 의해 생성 된 계보 트리 표시 됩니다. 모든 계보 나무에서: “N” 묘사 포스트 mitotic neuroblasts; “G”, 무부하 GFAP 긍정적인 세포; “X”, 세포의 죽음; 및 “?” 잃어버린된 셀. 눈금 막대 나타냅니다 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 라이브 영상 하 고 또한 분석을 추적 하는 단일 셀 신경 인구의 철새 용량의 정확한 판독을 제공 한다. 이러한 정보는 스크래치 상처 분석 결과20, 평균 거리는 이다 (그림 3) 상처를 닫을 때 여행에 관한 정보 생성의 소 뇌 이다 출생 후 개에서 얻은 했다. 또한, 다른 실험을 통해 변경 되지 않은 반면 일부는 이다 치유 과정에서 분할 보고 가능 했다. 기 막히게, 그 분할 분할 비 들 보다 (두 번까지 평균적으로 여행 하는) 더 많은 다 작의 철새 행동을 전시 하 보인다. 이 현상은 부상, 클래식 끝점 분석 실험의 읽기에 밖으로 희석 된 것에 따라 흉터를 이다 용량에 매우 흥미로운이 나왔다. 그림 3. 처음에 산 후 소 뇌 이다의 철새 행동의 분석 분석 결과 상처. 단계 대조 이미지 다른 시간 점 (하루-높이: 분)에 상처를 묘사. 계보 나무, tTt 소프트웨어에 의해 생성 된 대표적인 행동, 세포 분열, 상처를 닫는 동안 이다의 측면에서 설명 합니다. 히스토그램 (평균 ± S.E.M.) 단일 셀 추적 분석 이다 여행 평균 거리를 보여줍니다. 눈금 막대 나타냅니다 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 시간 경과 비디오 현미경 실험의 또 다른 흥미로운 기능은 확산 및 분화 세포 인구에 비교 하는 능력입니다. N2a 세포 확산 (존재 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)) 또는 (0.5 S + 10 µ M 아라키 돈 산)의 분화를 촉진 하는 조건에서 도금 테스트. 반면 차별화 세포 증식 하지 않습니다 그리고 그들은 형성 한다 (그림 4B) neurites (그림 4A), 증식 조건 하에서 세포 계보 진행에 따라 가능 했다. 놀랍게도, 단일 셀 추적 허용 식민지와 다른 확산 구분할 수 용량 및 neurite 신장 (철회) 평가할 수 이후에 내보낼 수 있는 정확 하 고 정량적 데이터를 제공 하. 그림 4. N2a 세포 생물학 확산 (A) 또는 분화 조건 (B)의 모니터링. 단계 대조 이미지 다른 시간 점 (하루-높이: 분)에서 복제의 진행 묘사. 최종 이미지는 α-tubulin (녹색)에 대 한 게시물 영상 immunocytochemistry (PICC)에 해당합니다. (A) 단일 셀 추적 다른 세포의 증식 응답에서, 모니터링 사업부는이의 라운드 수 있습니다. 오른쪽, tTt 소프트웨어에 의해 생성 하는 계보 나무 N2a 세포의 증식 동작을 보여 줍니다. (B) 세포 분화 조건 하에서 세포 주기 고 neurites, 후 이미징 분석에 의해 효과적으로 측정 될 수 있는 프로세스 생성. 단일 셀 추적, 오른쪽에 리니지 트리 표현, N2a 셀 세포 주기를 종료 하 고 분화 조건 하에서 세포 분열을 중지 하는 방법을 보여 줍니다. 눈금 막대는 50 µ m을 나타냅니다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 마지막으로, 라이브 영상 이며 단일 셀 추적 매우 셀 프로그래밍에 제출 하는 경우 형태학 및 분자 변화를 모니터링 하는 데 유용 합니다. 출생 후 이다 Achaete-으 체 1 (Ascl1)로 불리고의 라이브 이미징 이다 재설정된 ( 참조 되는 때 프로그래밍 또는 세포 분열의 방해 하는 동안 발생 하는 형태학 상 변화에 관한 귀중 한 데이터를 제공 합니다. 그림 5). 또한, 녹색 형광 단백질 (GFP) 더블 Cortin (DCX) 발기인의 통제에 대 한 구문 인코딩 변환, Ascl1 변환 결합 될 때 그것은 지점을 정의 합니다 정확한 시간 때 신경 수 특정 마커 재설정된 셀 (그림 5)에 표시 하기 시작 합니다. 시간 경과 비디오 현미경은 또한 계량 하이 과정 동안 죽을 셀에 비해 프로그래밍을 성공적으로 완료 하는 셀의 수를 수 있습니다. 이러한 이벤트를 모니터링 했다 성공적으로 재설정된9셀에 중요 한 “검사점”의 id에 지도 했다. 그림 5. 출생 후 대뇌 피 질의 이다 신경 프로그래밍을 복종의 분석. 프로그래밍 프로 neurogenic Ascl1 레드 형광 단백질 (RFP) 벡터와 변환에 의해 유도 했다. 신경 변환 DCX 발기인의 통제 GFP를 인코딩 벡터와 공동 변환에 의해 모니터링 했다. 단계 대조 이미지 표시 다른 시간 점 (하루-높이: 분)에 프로그래밍의 진행. RFP GFP 식의 형광 이미지 각각. 라이브 이미징 및 형태학 상 변화, 세포 분열, 세포 죽음, 프로그래밍 하는 동안의 부재 등 따라야 할 중요 한 이벤트를 허용 하는 단일 셀 추적 및 재설정된 세포 신경 마커를 표현 하기 시작 하는 때 정확한 시간을 정의할 수 있습니다. . 눈금 막대 나타냅니다 80 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

라이브 이미징의 가장 중요 한 가치 중 하나 정확한 혈통 추적, 신경 인구에서 혈통 진행의 중요 한 측면을 elucidating 수행 가능성입니다. 계보 추적 식별으로 정의 되 고 후속 복제에 복제의 설립자에서 단일 조상의 모든 자손의 모니터링21를 형성. 놀랍게도, 혈통 추적 (예, 바이러스 성 변환 또는 다 색 기자 구문21)에 대 한 고용 하는 다른 방법을 중요 한 결점, 그것에 의하여 최종 결과 여전히 사진을 기반으로 하 고 그것은 필요 하지 않습니다. 전체 시퀀스를 구성 합니다. 즉, 세포 죽음, 세포 인구, 희석, 마커, 함께 다른 중요 한 장애의 확산 또는 빈약한 효율성의 동작에이, 이어질2의 결과 불완전 하거나 잘못 된 지요. 또한, 라이브 이미징 활성화 모드 및 세포 분열, 세포 성장, 이동, 분화, 세포 주기 길이, neurite 확산의 타이밍 등 신경 인구의 생물학의 중요 한 특징을 분석 하는 연구원 형성, 복잡성 및 길이, 세포 운명 선택 (차별화), 또는 (프로그래밍) 변환.

또한, 라이브 이미징 보충 될 수 있다 쉽게 다른 분석 데이터를 얻기 위해와 같은 단일 셀에서 예를 들어 의도 RNA 시퀀싱. 그러나, 라이브 이미징 및 다른 기술이 결합된 혜택을 달성 하려면 이전 영화에서 모니터링 하는 그 세포는 나중에 다시 확인 하 고 개별적으로 2 차 분석을 위해 수집. 이 특정 셀에 대 한 형광 기자를 적용 하거나 참조로 셀 그룹의 분포를 분석 하 여 위치 좌표를 포함 하는 현미경을 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 실제로, transcriptome 프로필의 조합과 개별 셀의 셀의 생물학에 관련 된 새로운 분자 신호를 명료 하 게 하는 강력한 경로 나타낼 수 있습니다.

라이브 이미징 실험을 손상 시킬 수 있는 주요 문제 중 하나는 부적 절 한 셀 문화 밀도입니다. 앞에서 설명한 대로 높은 밀도에서 파편 또는 가난한 분리 (덩어리 형성)의 초과 수 있습니다 영향을 품질 및 단일 셀 추적 unfeasible 만드는 이미지의 공간 해상도. 따라서, 세포 배양의 생존 능력을 타협 하지 않고 뚜렷한 세포 인구 연구의 조건 가능한 셀의 낮은 수에 조정 되어야 한다.

이미지 수집의 주파수 또한 중요 하 고 신중 하 게 조정 해야, 형광 조명 사용 하는 경우에 특히. 노출에 전송 하 고 특히 형광 빛 세포 생존 능력을 손상 시킬 수 있습니다. 또는, 이미지 캡처 사이 과도 한 지연 분석의 시간 해상도 방해할 수 있습니다.

라이브 이미징 실험 기간 동안 다른 중요 한 단계는 초점의 정기 조정 이다. 실패는 올바른 설정/다시-setting 초점 거리의 단일 셀 추적을 방해 수 있습니다. 또한, 그것은 외피 챔버 유지 적절 한 온도, 습도, 및 CO2 레벨, 세포 죽음을 유도 수 있습니다 원치 않는 변이 개정 신중 하 게 확인 하는 데 필요한.

마지막으로,는 PICC을 수행 그것은 제대로 이미지 수집의 마지막 라운드 전에 xyz 제로 위치를 검색 하는 것이 중요. 잘못 된 다시는 xyz의 제로 위치 설정을 것입니다 어렵게 방해한 셀 자손의 식별 단계 대조 및 면역 형광 이미지에 맞게.

이 접근은 많은 긍정적인 면, 비록 신경 인구의 라이브 영상 몇 가지 제한이 아직도 지속 한다. 예를 들어, aNSCs의 성공적인 단일 셀 추적 하는 데 필요한 낮은 세포 밀도 하면14더럽혀 서 같은 생 화 확 적인 분석 실험을 사용 하는 게 불가능 한 있습니다. 또한, 또는 소 뇌 이다 같은 빠른 인구 분할 모니터링 N2a 셀은 일시적으로 제한 되 고 그것은 종종 너무 합류 근처 문화도 셀을 추적 하기 어려운. 또한, 셀, 격리와 관련 된 고유한 생물학 제한으로 많은 문화 방법, 종종 손상 세포 생존 능력 오랜 기간 동안 라이브 이미징 실험의 기간을 제한. 마지막으로, 그들의 자연 환경에서 세포를 분리 긍정적이 고 부정적인 효과가 있다. 세포 생리 그들의 틈새에서 고립 된 그들의 행동을 조절 하는 중요 한 신호를 수신 하지 못할 수 있습니다 동시에 그것은 특정 신경의 계보 진행에 그 신호의 효과 개별적으로 테스트 하는 강력한 수단을 나타냅니다 인구입니다.

위에서 설명한 한계를 감안할 때, 그것은 분명 그 완벽 한 방법론 시나리오 정상적인 생리 적인 조건 vivo에서 라이브 이미징 및 단일 셀 추적 실험을 수행 하는 것. 그러나, 현재 기술 두뇌2깊은 지역에서 오랜 기간에 대 한 단일 셀을 따를 수 없습니다. 따라서, 라이브 이미징의 미래는 완전히 생리 환경3의 가장 작은 방해 가능한 vivo에서 단일 세포의 세포 생물학 분석을 목표로이 제한 극복에 집중 해야 한다.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

그림 1에서 그녀의 지원 및 예술 작품에 감사 Beatriz Gascon 하 고. 우리는 또한 그의 도움에 대 한 박사 C. 노리 스 감사합니다. 여기에 제시 된 작품 연구 교부 금, “빨간 드 excelencia Consolider Ingenio 스페인어 이온 채널 이니셔티브”에 의해 지원 되었다 (BFU2015-70067REDC), 멕 (BFU2014-53654-P), BRADE-CM (S2013/얼음-2958), UCM-산탄데르 (PR26/16-18B-3)와 Fundación 라몬 Areces 그랜트 프로그램 (PR2018/16-02). Ramon y Cajal 프로그램 스페인 경제와 경쟁력을 인정 하는 펠리페 오르테가 (MEC: RYC-2013-13290).

Materials

Poly-D-lysine Sigma P0899 Working solution 0.02 mg mL-1
24 wells plate Falcon 352047
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM): F12 Nutrient Mixture medium (-L Glutamine) Invitrogen 21331-020
DMEM High Glucose medium Sigma D6546
Bovine Serum Albumin Sigma A6003
Triton X-100 Merck 11869 non-ionic surfactant
Mouse anti-β III Tubulin Sigma T8660
Rabbit anti-GFAP DakoCytomation Z0334
Mouse anti-α Tubulin Sigma T5168
Anti-Mouse FITC Jackson Laboratories 715-095-150
Anti-Rabbit Cy3 Jackson Laboratories 711-165-152
Brightfield/Phase contrast/fluoresence microscope Nikon TE-2000-E
CFI PLAN FLUOR DLLL 10X objetives Nikon Ref 280MRH10101
CFI SUPER PLAN FLUOR ELWD AMD 20X objetives Nikon Ref 280MRH48230
pE-300 LED fluorescence Cool LED Ref Number 1981
310M-201 Incubation system (temperature) OKO-Lab Serial Nº VOF007307
Pro-ScanII  Motorized stage system Prior Serial Nº 60018
High precision microscope camera version 4.2 ANDOR Zyla VSC-03650
Specifc software for live imaging with timelapse module: NIS-Elements AR4.5 Nikon NIS-Elements AR4.5 -Hasp ID: 13CE819E
OKO touch Incubation system (CO2) OKO-lab Serial number 1716
Murine Neuro-2a Neuroblastoma Cell line ATCC ATCCCCL131
HEPES buffer solution 1 M Invitrogen 15630-056
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References

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Gómez-Villafuertes, R., Paniagua-Herranz, L., Gascon, S., de Agustín-Durán, D., Ferreras, M. d. l. O., Gil-Redondo, J. C., Queipo, M. J., Menendez-Mendez, A., Pérez-Sen, R., Delicado, E. G., Gualix, J., Costa, M. R., Schroeder, T., Miras-Portugal, M. T., Ortega, F. Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations. J. Vis. Exp. (130), e56291, doi:10.3791/56291 (2017).
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