يعيش تصوير متبوعاً بخلية واحدة تتبع لرصد خلية علم الأحياء وتطور نسب السكان العصبية متعددة
Summary
ويرد وصف بروتوكول قوية لمراقبة السكان العصبية بالفيديو-الفحص المجهري الوقت الفاصل بين تليها مرحلة ما بعد المعالجة المستندة إلى البرامج. ويمثل هذا الأسلوب أداة قوية لتحديد الأحداث البيولوجية في عدد سكان محدد أثناء تجارب التصوير الحي.
Abstract
فهم الآليات التي تتحكم في الأحداث البيولوجية الحرجة من السكان الخلايا العصبية، مثل انتشار أو التفريق أو خلية مصير القرارات، سوف تكون حاسمة بالنسبة لتصميم الاستراتيجيات العلاجية للعديد من الأمراض التي تصيب الجهاز العصبي. الأساليب الحالية لتعقب خلية السكان يعتمدون على نتائجها النهائية في الصور الثابتة وعموما فشلوا في تقديم القرار الزمنية الكافية لتحديد السمات السلوكية في الخلايا المفردة. وعلاوة على ذلك، الاختلافات في موت الخلية، تغاير السلوكية داخل سكان خلية، وتمييع، نشر، أو انخفاض كفاءة العلامات المستخدمة لتحليل الخلايا هي جميع العوائق الهامة التي سوف تؤدي إلى read-outs غير مكتملة أو غير صحيحة من النتائج. على العكس من ذلك، إجراء تصوير مباشر ووحيد الخلية تتبع ظروف ملائمة يمثل أداة قوية لرصد كل من هذه الأحداث. هنا، يتم وصف بروتوكول الوقت الفاصل بين الفحص المجهري الفيديو، تليها مرحلة ما بعد المعالجة، لتعقب السكان العصبية مع القرار خلية مفردة، باستخدام برامج معينة. الأساليب الموصوفة تمكن الباحثين من معالجة المسائل الأساسية المتعلقة بتطور علم الأحياء والنسب خلية السكان العصبية متميزة.
Introduction
من أجل تطوير استراتيجيات علاجية جديدة وأكثر فعالية لتجديد السكان العصبية، يجب علينا أولاً أن نفهم الآليات الأساسية التي تحافظ على خلايا مع احتمال العصبية التجدد. السعي إلى تحقيق هذا الهدف يتطلب معرفة شاملة بالعوامل التي تنظم التوازن بين التتابع وانتشار/التمايز، ووضع وتوقيت لشعبة، طول دورة الخلية، القدرات المهاجرة، والجدوى، إلخ. على الرغم من اتباع نهج تقنية التي استخدمت للعديد من السنوات1، يعيش التصوير والمراقبة المباشرة لا تزال أفضل خيار لرصد الأحداث المذكورة أعلاه. خلافا للعديد من النهج الأخرى التي تركز على قراءات نقطة النهاية، يعيش التصوير وخلية واحدة تتبع معلومات طوال مدة التجربة2،3،،من45، 6-وهكذا، يتيح إضافة الأزمنة موت الخلية أو سلوك الخلية غير متجانسة أو خلية مصير القرارات، فضلا عن العديد من الآخرين الأحداث الهامة اسمه أن خلاف ذلك قد يمر دون أن يلاحظها أحد. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن ترصد هذه الميزات من الخلايا أفضل في خلية مفردة مستوى المجراة، حيث كلا الجوهرية (خلية المتمتعة بالحكم الذاتي) والخارجية العظة (الخلية المتخصصة) تؤخذ في الاعتبار.
ومع ذلك، على الرغم من أن في في المختبر أحداث حالة تحدث في بيئة لا تتكاثر على الوسط الطبيعي، الشروط الثقافة المنخفضة الكثافة المستخدمة عادة في هذه البروتوكولات أكثر مناسبة للكشف عن الخصائص الجوهرية الخلايا. وعلاوة على ذلك، عنصر تحكم مبسطة أكثر من الوسط المحيطة به، ببساطة تعديل المتوسطة النمو، قد تشكل أداة قيمة للتحقيق في دور فردية لكل عامل خارجية أن يعرف مكانة العصبية، فضلا عن العوامل البيئية التي قد أن يتسبب في الحالات المرضية7،8،9،10،11،،من1213. ولذلك، عند تكوينه بشكل صحيح، كما هو الحال في البروتوكول المقترح هنا، تصوير مباشر يوفر حلاً عمليا في المختبر لمعالجة معظم المسائل المذكورة سابقا.
وباختصار، يصف هذا البروتوكول الأجهزة والبرمجيات، وشروط الثقافة والخطوات الرئيسية المطلوبة لنجاح إجراء تجربة تصوير الحي متبوعاً بخلية واحدة فقط تتبع. ويوفر هذا النهج قيمة المعلومات التي تساعد على الكشف عن الجوانب الأساسية لعلم الأحياء وتطور النسب، السكان العصبية متعددة.
Protocol
Representative Results
Discussion
واحدة من أهم القيم من تصوير مباشر هو إمكانية القيام بتتبع نسب دقيقة، توضيح الجوانب الحرجة لتطور النسب في عدد سكان العصبية. يعرف بأنه تحديد النسب تعقب ورصد جميع ذرية من السلف مفردة، من مؤسس الاستنساخ لاستنساخ اللاحقة شكلت21. بشكل ملحوظ، الطرق البديلة المستخدمة للنسب التتبع (مثلاً، وتوصيل الفيروسية أو مراسل متعدد الألوان بنيات21) قد عيب حرجة، حيث يستند النتيجة النهائية ما زالت الصور وأنه لا بالضرورة وتشكل سلسلة كاملة. وهذا يعني أن موت الخلية، التباين في سلوك السكان الخلية، وتمييع، كفاءة نشر أو الفقيرة من العلامات، جنبا إلى جنب مع عوائق هامة أخرى، يؤدي إلى read-outs غير مكتملة أو غير صحيحة ل نتائج2. وعلاوة على ذلك، يتيح تصوير يعيش الباحث لتحليل السمات الهامة لبيولوجيا العصبية من السكان، مثل أسلوب وتوقيت انقسام الخلايا ونمو الخلايا، والهجرة وانتشار مقابل التمايز، ومدة دورة الخلية، نيوريتي تشكيل والتعقيد والطول، خلية تحديد مصير (التمايز)، أو التحويل (إعادة برمجة).
وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تستكمل تصوير مباشر بسهولة مع التحليلات الأخرى تهدف إلى الحصول على بيانات من خلايا مفردة مثل، على سبيل المثال، تسلسل الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، تحقيق الفائدة المشتركة من التصوير الحي وغيرها من التقنيات تتطلب تلك الخلايا التي سبق رصدها في الأفلام في وقت لاحق إعادة تحديد والتي جمعت على حدة للتحليل الثانوي. يمكن تحقيق ذلك باستخدام المجاهر التي تتضمن الإحداثيات الموضعية، بتطبيق الصحفيين الفلورسنت لخلايا معينة أو بتحليل توزيع مجموعات من الخلايا كمراجع. في الواقع، المزيج من التشكيل الجانبي الترنسكربيتوم وسلوك الخلايا الفردية قد تمثل طريقا قوية توضيح الرموز الجزيئية الجديدة تشارك في بيولوجيا الخلايا.
واحدة من المشاكل الرئيسية التي يمكن أن تنال من تجربة تصوير الحي بكثافة ثقافة خلية غير كافية. كما ذكر سابقا، في كثافة عالية الفائض من الحطام أو الانفصال الفقراء (تشكيل أجمة) قد تؤثر على نوعية والقرار المكانية للصور، مما يجعل تعقب خلية مفردة غير مجد. ولذلك، ينبغي تعديل ظروف السكان خلية متميزة تحت الدراسة بأقل عدد من الخلايا ممكن دون المساس باستمرارية ثقافة الخلية.
تكرار الحصول على الصور هي أيضا حاسمة وينبغي تعديلها بعناية، خاصة عندما يتم استخدام الإضاءة الفلورية. الإفراط في التعرض لإرسالها، ولا سيما الأسفار الضوء قد يعرض للخطر بقاء الخلية. بدلاً من ذلك، قد تتداخل تأخير زائد بين التقاط الصور مع القرار الزمني للتحليل.
خطوة حاسمة أخرى خلال التجربة الحية بالتصوير هو التعديل الدوري للتركيز. فشل في تصحيح الإعداد/إعادة-ستينغ من البعد البؤري قد يعيق تعقب خلية مفردة. وعلاوة على ذلك، من الضروري أن تحقق بعناية أن غرفة الحضانة يحافظ على درجة الحرارة المناسبة، والرطوبة، ومستويات2 CO، تعديل التغيرات غير المرغوب فيها التي قد تسبب موت الخلايا.
أخيرا، متى تم أداؤه مبادئ العقود التجارية الدولية، من المهم لاسترداد موضع xyz صفر قبل الجولة الأخيرة من الحصول على الصور بشكل صحيح. غير صحيحة إعادة تحديد xyz موضع صفر سوف تجعل من الصعب على تطابق الصور والمرحلة-على النقيض من الفلورة، إعاقة تحديد النسل الخلية.
على الرغم من أن هذا النهج له جوانب إيجابية كثيرة، ما زالت هناك بعض القيود لتصوير يعيش السكان العصبية. على سبيل المثال، الخلية منخفضة الكثافة المطلوبة للقيام بتعقب خلية واحدة ناجحة من أنسكس يجعل من المستحيل على توظيف فحوصات الكيمياء الحيوية، مثل الغربية النشاف14. بالإضافة إلى ذلك، رصد سريع تقسيم السكان مثل astrocytes الدماغ أو خلايا N2a مقيد وقتيا، غالباً ما يصعب جداً لتعقب الخلايا بالقرب من التقاء الثقافات. علاوة على ذلك، العديد من أساليب الثقافة، فضلا عن القيود المتأصلة البيولوجية المرتبطة بعزل الخلايا، غالباً ما يعرض للخطر بقاء الخلية على مدى فترات طويلة، تحد مدة تجارب التصوير الحي. وأخيراً، عزل الخلايا من بيئتها الطبيعية قد آثار إيجابية وسلبية على حد سواء. قد تفشل الخلايا المعزولة من مكانها الفسيولوجية لتلقي الإشارات الهامة التي تعدل سلوكها، في الوقت نفسه، فإنه يمثل وسيلة قوية اختبار تأثير تلك الإشارات على حدة في تطور النسب الخاصة بالعصبية والسكان.
ونظرا للقيود المذكورة أعلاه، فمن الواضح أن السيناريو منهجية مثالية القيام بتجارب تتبع الخلية التصوير وواحد يعيش تحت ظروف فيزيولوجية طبيعية في فيفو. التقنيات الحالية غير قادر على متابعة الخلايا المفردة لفترات طويلة من الزمن في المناطق العميقة من الدماغ2. ولذلك، ينبغي أن تركز مستقبل التصوير الحي على التغلب على هذا التحديد، تهدف إلى تحليل الكامل بيولوجيا الخلية من الخلايا المفردة في فيفو مع احتمال التدخل الأكثر بسيطة من البيئة الفسيولوجية3.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر جاسكون بياتريس لعملها المساعدة والفن في الشكل 1. كما نشكر الدكتور جيم نوريس لمساعدته. الأعمال المعروضة هنا أيد منح البحوث، “اكسسيلينسيا دي الأحمر مبادرة تدعيم إنجينيو الإسبانية أيون قناة” (BFU2015-70067REDC)، وزارة التعليم والعلوم (BFU2014-53654-P) وبرادي-سم (S2013/الجليد-2958)، UCM-سانتاندر (PR26/16-18 باء-3) ومؤسسة رامون برنامج منح أريسيس (PR2018/16-02). فيليبي اورتيجا تسلم y رامون كاجال برنامج وزارة الاقتصاد الإسبانية والقدرة التنافسية (MEC: تأهيل-2013-13290).
Materials
| Poly-D-lysine | Sigma | P0899 | Working solution 0.02 mg mL-1 |
| 24 wells plate | Falcon | 352047 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM): F12 Nutrient Mixture medium (-L Glutamine) | Invitrogen | 21331-020 | |
| DMEM High Glucose medium | Sigma | D6546 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A6003 | |
| Triton X-100 | Merck | 11869 | non-ionic surfactant |
| Mouse anti-β III Tubulin | Sigma | T8660 | |
| Rabbit anti-GFAP | DakoCytomation | Z0334 | |
| Mouse anti-α Tubulin | Sigma | T5168 | |
| Anti-Mouse FITC | Jackson Laboratories | 715-095-150 | |
| Anti-Rabbit Cy3 | Jackson Laboratories | 711-165-152 | |
| Brightfield/Phase contrast/fluoresence microscope | Nikon | TE-2000-E | |
| CFI PLAN FLUOR DLLL 10X objetives | Nikon | Ref 280MRH10101 | |
| CFI SUPER PLAN FLUOR ELWD AMD 20X objetives | Nikon | Ref 280MRH48230 | |
| pE-300 LED fluorescence | Cool LED | Ref Number 1981 | |
| 310M-201 Incubation system (temperature) | OKO-Lab | Serial Nº VOF007307 | |
| Pro-ScanII Motorized stage system | Prior | Serial Nº 60018 | |
| High precision microscope camera version 4.2 | ANDOR Zyla | VSC-03650 | |
| Specifc software for live imaging with timelapse module: NIS-Elements AR4.5 | Nikon | NIS-Elements AR4.5 -Hasp ID: 13CE819E | |
| OKO touch Incubation system (CO2) | OKO-lab | Serial number 1716 | |
| Murine Neuro-2a Neuroblastoma Cell line | ATCC | ATCCCCL131 | |
| HEPES buffer solution 1 M | Invitrogen | 15630-056 |
References
- Conklin, E. G. The Mutation Theory From the Standpoint of Cytology. Science. 21 (536), 525-529 (1905).
- Ortega, F., Costa, M. R. Live Imaging of Adult Neural Stem Cells in Rodents. Front Neurosci. 10, 78 (2016).
- Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1137-1144 (2016).
- Schroeder, T. Tracking hematopoiesis at the single cell level. Ann N Y Acad Sci. 1044, 201-209 (2005).
- Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453 (7193), 345-351 (2008).
- Etzrodt, M., Endele, M., Schroeder, T. Quantitative single-cell approaches to stem cell research. Cell Stem Cell. 15 (5), 546-558 (2014).
- Ortega, F., et al. Oligodendrogliogenic and neurogenic adult subependymal zone neural stem cells constitute distinct lineages and exhibit differential responsiveness to Wnt signalling. Nat Cell Biol. 15 (6), 602-613 (2013).
- Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138 (6), 1057-1068 (2011).
- Gascon, S., et al. Identification and Successful Negotiation of a Metabolic Checkpoint in Direct Neuronal Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).
- Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell Stem Cell. 11 (4), 471-476 (2012).
- Kleiderman, S., et al. Conversion of Nonproliferating Astrocytes into Neurogenic Neural Stem Cells: Control by FGF2 and Interferon-gamma. Stem Cells. 34 (12), 2861-2874 (2016).
- Bunk, E. C., et al. Prox1 Is Required for Oligodendrocyte Cell Identity in Adult Neural Stem Cells of the Subventricular Zone. Stem Cells. 34 (8), 2115-2129 (2016).
- Aravantinou-Fatorou, K., et al. CEND1 and NEUROGENIN2 Reprogram Mouse Astrocytes and Embryonic Fibroblasts to Induced Neural Precursors and Differentiated Neurons. Stem Cell Reports. 5 (3), 405-418 (2015).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6 (12), 1847-1859 (2011).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6 (2), 214-228 (2011).
- Jimenez, A. I., et al. Potentiation of ATP calcium responses by A2B receptor stimulation and other signals coupled to Gs proteins in type-1 cerebellar astrocytes. Glia. 26 (2), 119-128 (1999).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
- Ortega, F., Berninger, B., Costa, M. R. Primary culture and live imaging of adult neural stem cells and their progeny. Methods Mol Biol. 1052, 1-11 (2013).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Yu, A. C., Lee, Y. L., Eng, L. F. Astrogliosis in culture: I. The model and the effect of antisense oligonucleotides on glial fibrillary acidic protein synthesis. J Neurosci Res. 34 (3), 295-303 (1993).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
