用高光谱共聚焦显微镜和荧光寿命成像对发光共轭吩染色的淀粉样组织的成像
Summary
淀粉样蛋白沉积是不同疾病的标志, 并影响许多不同的器官。本文介绍了荧光结合吩荧光染色技术在光学显微镜下的应用。这种染色方法是一种强有力的工具, 用于检测和探索蛋白质集在临床和科学的设置。
Abstract
在全身的组织中沉积为淀粉样蛋白的蛋白质可能是大量疾病的起因或后果。其中, 我们发现神经退行性疾病, 如阿尔茨海默氏症和帕金森病, 主要困扰中枢神经系统, 和系统性淀粉样变性, 血清淀粉样蛋白 A, 蛋白和 IgG 光链作为淀粉样蛋白在肝脏, 腕隧道, 脾脏, 肾脏, 心脏, 和其他周围组织。淀粉样蛋白已被称为和研究了一个多世纪, 通常使用淀粉样蛋白的特定染料, 如刚果红和 Thioflavin 吨或 Thioflavin (这)。本文以 heptamer-甲酰基噻吩乙酸 (hFTAA) 为例, 对这些染料进行了新的补充, 称为发光共轭吩。hFTAA 易于使用, 并与 co-staining 免疫荧光或其他细胞标记相容。广泛的研究已经证明, hFTAA 检测的疾病相关的蛋白质总量比传统的淀粉样染料的范围更广。此外, hFTAA 也可用于光学分配的不同的聚合 morphotypes, 以允许研究淀粉样纤维多态性。虽然应用的成像方法是可选的, 我们这里演示高光谱成像 (他), 激光扫描共聚焦显微镜和荧光寿命成像 (电影)。这些例子显示了一些成像技术, 在那里, 可利用 amyloids 作为工具, 以获得更详细的知识的形成和结构的性质的。对该技术的一个重要限制是, 就所有传统光学显微镜技术而言, 对集料的微观尺寸的要求, 以允许检测。此外, 骨料应包括一个重复的β表结构, 以允许 hFTAA 约束力。过多的固定和/或表位接触, 修改的聚合结构或构象, 可以呈现较差的 hFTAA 结合, 因此对精确成像的限制。
Introduction
淀粉样蛋白在组织中的沉积是一些疾病的病理特征, 如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、系统性淀粉样变性和朊病毒病。尽管与淀粉样蛋白相关的疾病普遍存在, 而且到目前为止, 近40种不同的蛋白质被归类为人类1中的淀粉样前体, 但对淀粉样蛋白沉积与疾病表型之间的关系知之甚少。从人类病人的标本组织学已经被用于诊断和科学目的。已经建立了大量的动物模型来研究淀粉样蛋白负荷与行为、寿命和其他一些疾病进展的表型读出之间的相关性2,3。在药物发现和设计方面也作出了巨大的努力, 以抗击我们最害怕的广泛疾病。然而, 对基因型、表型、淀粉样斑块负荷与药物管理之间的关系的评价并不直接。用于组织中淀粉样蛋白染色和成像的工具通常是钝性的, 并提供低分辨率的淀粉样蛋白的形成和结构信息。
刚果红双折射, 和荧光是典型的方法, 检测和分析组织样本中的淀粉样的负担, 从病人活检和验尸样本, 和动物模型的疾病4。这些技术已经使用了几十年 (自二十世纪二十年代以来的刚果红和自二十世纪六十年代以来的衍生品和衍生物), 虽然仪器已被提炼, 并允许详细分析, 染色程序和分析仍在执行在几乎一个世纪前的同样的方式。
在本文中, 我们描述了一种高度敏感的新的淀粉样蛋白染料的利用, hFTAA5, 这使得检测小未成熟蛋白质沉积高准确度, 以及检测成熟淀粉样。与传统染料相比, hFTAA 已被证明可以检测到更广泛的疾病相关蛋白聚集5,6,7。此外, hFTAA 还可以应用于不同的聚合 morphotypes8的光学分配。在这里, 我们描述 hFTAA 染色和分析的组织从建立的朊病毒疾病和淀粉样β前体蛋白 (APP) 转基因小鼠的设计, 以模拟斑块发育阿尔茨海默病的研究9,10.我们还展示了对系统性淀粉样变性患者的诊断和尸检样本的分析。这些有内在属性, 使他们能够报告在一个牌匾的构象差异;并结合两个不同的属性与绑定和荧光的性质, 差异更显着11。一种荧光显微镜, 装有长通滤波器和高光谱相机头, 用于实现光谱特性的客观分类和显微谱分析的记录。以可调谐激光为激发源的共焦荧光显微镜对淀粉样蛋白的三维性质进行了更详细的评价。可调谐激光可以收集的激励频谱和一步少选择发射波长的显微镜下, 使 co-imaging 的柴油荧光和免疫荧光, 以确定共存的目标蛋白和淀粉样。电影提供了前所未有的敏感性, 对构象差异强加给了污染和揭示的差异, 可能无法检测的荧光发射光谱。
所述染色方法的主要目的是促进对小淀粉样沉积物的灵敏检测, 并在淀粉样沉积物中表征构象多态性。这些知识对于蛋白质聚集疾病的基本理解是非常重要的。
Protocol
Representative Results
Discussion
aberrantly 折叠蛋白在淀粉样蛋白中的沉积是许多疾病过程的重要事件。在阿尔茨海默病患者的大脑中, 由 hyperphosphorylated tau a 肽和胞内纤维缠结组成的胞外淀粉样斑块被发现。一系列不同的蛋白质,例如, 蛋白 (TTR), 血清淀粉样蛋白 A 组分 (升), 和 IgG 轻链错误和表现为淀粉样沉积在组织外的中枢神经系统。虽然淀粉样沉积物已被认识和研究了一个多世纪, 我们仍然缺乏详细的知识如何开始在分子水平的淀粉样蛋白沉积, 以及可以做些什么来防止这个过程。对于阿尔茨海默氏病, 有必要证实淀粉样变性的过程是如何与神经相关的。治疗淀粉样变性的一个关键任务是开发新的 fine-tuned 工具来监测淀粉样蛋白的起始、进展和回归;因此, 靶向淀粉样蛋白检测是关键。从长远看, 临床诊断将受益于提高淀粉样染色方法的灵敏度和选择性7,15。目前在这方面的挑战是巨大的, 是一个非常积极的研究领域。临床发展和试验的一个主要问题是预后诊断。这些疾病很可能在症状出现之前就开始, 但从治疗开始, 需要对疾病进行鉴别。在这里, 灵敏度是新方法的一个关键方面。此外, 这个问题更复杂, 因为一些蛋白质聚集物是有毒的, 有些是保护性的, 有些是中性的。因此, 有能力监测特定的聚集 morphotypes 是必不可少的, 因为存在不同的聚集物种已被建议解释的异构表型报告的多样性神经退行性蛋白聚集疾病。例如, 朊蛋白是一个典型的例子, 一个相同的主要氨基酸序列如何可以错误成不同的聚合 morphotypes, 从而产生特定的朊病毒菌株。同样的多态性也报告了 a 肽, α-核, 和 tau。在这方面, 已被证明是不同的聚合 morphotypes 光学分配的杰出工具。由于构象引起的光学现象, 在不同类型的系统性淀粉样变性, 以及多态性 a 和 tau 聚合体中发现了朊蛋白-菌株特异的蛋白质聚集物。
淀粉样蛋白沉积是发生在难以穿透生物化学或生物物理方法的分子精确度的组织中的事件。探测事件的可能性ex 体内,在体内, 和在体外使用相同的柴油分子设置的阶段, 以解开事件发生在体内使用的技术, 只可能适用于ex 体内或体外示例11,17。最近报告的高分辨率结构模型表明, 柴油 pentameric 自由贸易区 (pFTAA) 绑定在由平行的侧链形成的腔中, 并与纤维轴并行, 在寄存器内并行测试链18, 这表明它是可能获得有关柴油目标实体的原子解析知识。实质上, pFTAA 的结合腔和结合模式与刚果红19相似, 由一个带有重复的正电荷的赖氨酸侧链的凹槽所决定。与刚果红的亲和力似乎更好, 因为链的灵活性和强大的范德华相互作用的硫原子的噻吩环对疏水腔。prefibrillar 物种的检测 (在响应之前)5,20出现依赖于重复的β板料, 由寄存器平行β-股组成, 其中 hFTAA 比 pFTAA 更长的两个噻吩单位跨度跨越8β-股。
染色协议需要注意以下步骤的问题: (i) 固定: 组织样品的广泛固定可以扰乱淀粉样结构, 并限制检测荧光光谱变化的可能性。hFTAA 分子的构象畸变。从新鲜冷冻材料中 cryosections 的轻度固定是获得最佳光谱分辨率的首选。然而, hFTAA 会在固定组织中染色和荧光淀粉样蛋白, 但功效降低, 光谱变异较少。(ii) 表位暴露: 由于淀粉样蛋白结构的紊乱, 组织的前处理以达到表位抗体结合的接触可能会偶尔降低 hFTAA 的结合能力。如果这是一个问题, 和表位暴露是一个关键步骤的抗体染色协议, 使用连续的部分抗体和 hFTAA, 分别可以考虑。(iii) Overstaining: hFTAA 是非常敏感的。工作解决方案应保持在低 nM 浓度。如果背景染色是一个问题, 则降低 hFTAA 的浓度。如果束缚 hFTAA 的元素在组织中是稀疏的, 过量的 hFTAA 可以聚集并积聚在安装介质中。这是公认的荧光, 不是在焦点平面的组织本身。如果出现这种情况, 请将安装的幻灯片浸入 pbs, 直到盖板滑动到剖面上, 用 pbs 清洗, 然后重新装入新的安装介质, 并重新盖上盖子。(iv) 基于滤波器的成像: 本文主要介绍利用长通滤波器或多个检测通道进行光谱分辨荧光成像。hFTAA 也可以使用短传递过滤器进行监控。请注意, 这将减少对比度, 并取消检测多种颜色的可能性。
在过去的几年中, 越来越明显的是, 作为研究工具, 荧光管, 特别是 hFTAA 显示了非常有希望的性质。结果已经证明了大量的蛋白质和疾病状态, 从 hFTAA 检测的聚集细胞内 (tau, 包涵体肌炎), 系统性淀粉样蛋白 a, 蛋白, 免疫球蛋白轻链 (卡帕和λ) seminogelin 1, 朊蛋白 (包括临床样品)21, 胰岛淀粉样多肽, 和胰岛素7,15。作为诊断工具实施 hFTAA 的一个限制因素是, 荧光显微镜在常规的淀粉样蛋白病理实验室中没有被广泛使用。此外, 他在诊所也不容易得到。然而, hFTAA 淀粉样染色和荧光显微镜已用于临床实验室在一个过滤器为基础的荧光显微镜, 并应被认为是一种免费的诊断方法。这是最近在腕管活检与蛋白淀粉样变性使用的基本设置荧光在一个自动化的时尚22。
此外, 除了各种蛋白质外, hFTAA 荧光还能识别出大量的纤维类型和 pre-fibrillar 淀粉样的聚合体,例如, 检测到了通路纤维物种并进行了定性。在本刊物中, 我们已经展示了一个柴油的各种样本类型使用三显微镜技术。受控合成的使用也允许开发用于生物分子目标的多用途检测,例如, 通过表面等离子体共振 (SPR)23和 radiolabeling 的相互作用记录正电子发射断层扫描 (PET)24。
到目前为止, 已有超过25不同的已发布。增加对淀粉样沉积物的影像学的使用将增加对这些疾病相关的聚合体如何聚集、分解和干扰它们所居住的器官和个体的认识和理解。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者希望感谢迈克尔林格伦和南 Sluzny 关于荧光显微镜的建议, 和阿德里亚诺 aguzzi-dur, 约翰 Bijzet, Bouke Hazenberg, 弗兰克赫普纳, Jucker, 苔蕾丝 Klingstedt, 卡琳马格努森, 克里斯蒂娜 Sigurdson, 丹尼尔 Sjölander,克里斯托弗 Röcken, 古尼拉 Westermark, 每 Westermark, 和库尔特 Zatloukal 的贡献组织部分或显微显示在本出版物。本文所收集的数据由瑞典脑基金会 (Hjärnfonden)、瑞典阿尔茨海默病协会 (Alzheimerfonden)、瑞典研究理事会 (VR)、约兰·佩尔松 Gustafsson 协会、乔治和 #38 的捐款提供资金。奥尔森, 欧盟 FP7 健康项目 LUPAS, 林雪平大学。
Materials
| hFTAA/Amytracker545 | Ebba Biotech | ||
| Dako fluorescene mounting medium | Agilent technologies | GM304 | |
| LeicaDM6000 | Leica | ||
| Lumen 200 | Prior | ||
| Spectraview system | ASI spectral imaging | ||
| Spectraview software | ASI spectral imaging | ||
| LSM780 | Zeiss | ||
| Zen 2010b v6.0 software | Zeiss | ||
| FLIM system | Becker & Hickl | ||
| Ar/ML 458/488/514 | Zeiss | ||
| Tunable Laser In Tune | Zeiss |
References
- Sipe, J. D., et al. Amyloid fibril proteins and amyloidosis: chemical identification and clinical classification International Society of Amyloidosis 2016 Nomenclature Guidelines. Amyloid. 23, 209-213 (2016).
- Buxbaum, J. N. Animal models of human amyloidoses: are transgenic mice worth the time and trouble?. FEBS letters. 583, 2663-2673 (2009).
- Hall, A. M., Roberson, E. D. Mouse models of Alzheimer’s disease. Brain Res Bull. 88, 3-12 (2012).
- Westermark, G. T., Johnson, K. H., Westermark, P. Staining methods for identification of amyloid in tissue. Methods in enzymology. , 3-25 (1999).
- Klingstedt, T., et al. Synthesis of a library of oligothiophenes and their utilization as fluorescent ligands for spectral assignment of protein aggregates. Org Biomol Chem. 9, 8356-8370 (2011).
- Klingstedt, T., et al. Luminescent conjugated oligothiophenes for sensitive fluorescent assignment of protein inclusion bodies. Chembiochem. 14, 607-616 (2013).
- Sjolander, D., et al. Establishing the fluorescent amyloid ligand h-FTAA for studying human tissues with systemic and localized amyloid. Amyloid. 23, 98-108 (2016).
- Magnusson, K., et al. Multimodal fluorescence microscopy of prion strain specific PrP deposits stained by thiophene-based amyloid ligands. Prion. 8, 319-329 (2014).
- Radde, R., et al. Abeta42-driven cerebral amyloidosis in transgenic mice reveals early and robust pathology. EMBO Rep. 7, 940-946 (2006).
- Sturchler-Pierrat, C., et al. Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 13287-13292 (1997).
- Nystrom, S., et al. Evidence for age-dependent in vivo conformational rearrangement within Abeta amyloid deposits. ACS chemical biology. 8, 1128-1133 (2013).
- Aslund, A., et al. Novel pentameric thiophene derivatives for in vitro and in vivo optical imaging of a plethora of protein aggregates in cerebral amyloidoses. ACS chemical biology. 4, 673-684 (2009).
- Nilsson, K. P., Herland, A., Hammarstrom, P., Inganas, O. Conjugated polyelectrolytes: conformation-sensitive optical probes for detection of amyloid fibril formation. 생화학. 44, 3718-3724 (2005).
- Mahajan, V., et al. Cross beta-sheet conformation of keratin 8 is a specific feature of Mallory-Denk bodies compared with other hepatocyte inclusions. Gastroenterology. 141, 1080-1090 (2011).
- Sjolander, D., Bijzet, J., Hazenberg, B. P., Nilsson, K. P., Hammarstrom, P. Sensitive and rapid assessment of amyloid by oligothiophene fluorescence in subcutaneous fat tissue. Amyloid. 22, 19-25 (2015).
- Arja, K., et al. Enhanced fluorescent assignment of protein aggregates by an oligothiophene-porphyrin-based amyloid ligand. Macromol Rapid Commun. 34, 723-730 (2013).
- Psonka-Antonczyk, K. M., et al. Nanoscale Structure and Spectroscopic Probing of Abeta1-40 Fibril Bundle Formation. Front Chem. 4, 44 (2016).
- Herrmann, U. S., et al. Structure-based drug design identifies polythiophenes as antiprion compounds. Sci Transl Med. 7, 299ra123 (2015).
- Schutz, A. K., et al. The amyloid-Congo red interface at atomic resolution. Angewandte Chemie (International ed). 50 (26), 5956-5960 (2011).
- Hammarstrom, P., et al. A fluorescent pentameric thiophene derivative detects in vitro-formed prefibrillar protein aggregates. 생화학. 49, 6838-6845 (2010).
- CORDIS. . Final Report Summary – LUPAS (Luminescent polymers for in vivo imaging of amyloid signatures). , (2013).
- Hahn, K., et al. Establishing and validating the fluorescent amyloid ligand h-FTAA (heptamer formyl thiophene acetic acid) to identify transthyretin amyloid deposits in carpal tunnel syndrome. Amyloid. , 1-9 (2017).
- Johansson, L. B., et al. An azide functionalized oligothiophene ligand–a versatile tool for multimodal detection of disease associated protein aggregates. Biosens Bioelectron. 63, 204-211 (2015).
- Nordeman, P., et al. (11)C and (18)F Radiolabeling of Tetra- and Pentathiophenes as PET-Ligands for Amyloid Protein Aggregates. ACS Med Chem Lett. 7, 368-373 (2016).
