AC confocal fluorescens mikroskopi og laser mikro-bestråling tilbud-verktøy for inducing DNA skade og overvåking responsen av DNA reparasjon proteiner sub kjernefysiske barokkarkitektur. Denne teknikken har betydelig avanserte vår kunnskap om skade gjenkjenning, signalisering og rekruttering. Dette manuskriptet viser disse teknologiene for å undersøke enkelt- og dobbeltrom strand pause reparasjon.
Svært koordinert DNA reparasjon trasé eksisterer for å oppdage, avgiftsdirektoratet og erstatte skadet DNA baser og koordinere reparasjon av DNA strand bryter. Mens molekylærbiologi teknikker har avklart struktur, enzymatisk funksjoner og kinetics reparasjon proteiner, er det fortsatt behov for å forstå hvordan reparasjon er koordinert i kjernen. Laser mikro-bestråling tilbyr et kraftig verktøy for inducing DNA skade og overvåking rekruttering av reparasjon proteiner. Induksjon av DNA skade av laser mikro-bestråling kan oppstå med et utvalg av bølgelengder, og brukere kan pålitelig indusere enkelt strand pauser, base lesjoner og doble strand bryter med en rekke doser. Her laser mikro-bestråling brukes til å undersøke reparasjon av enkelt og dobbelt strand bryter indusert av to vanlige AC confocal laser bølgelengder, 355 nm og 405 nm. Videre, riktig karakteristikk av brukt laser dosen for inducing spesifikk skade blandinger er beskrevet, slik at brukere kan reproduserbar utføre laser mikro-bestråling datainnsamling og analyse.
Fluorescerende mikroskopi har dukket opp som en kraftfull teknikk for å visualisere mobilnettet arkitektur, undersøke protein lokalisering og overvåke protein-protein og protein-DNA interaksjoner. Bruke lysstoffrør mikroskopi for å studere DNA skade svar etter globale DNA skadelige stoffer, som ultrafiolett (UV) lys, har ioniserende stråling, kjemiske oksiderende eller alkylating agenter eller chemotherapeutics gitt ny innsikt i den innvielsen signalering og rekruttering av DNA reparasjon proteiner til områder av DNA skade1,2. Men disse globale og asynkrone skade hendelser er begrensende, hvis detaljert informasjon om rekruttering ordre, kinetics av tilknytning eller dissosiasjon, og forholdet mellom nøkkel DNA reparasjon proteiner er søkt. Heldigvis fremskritt innen laserskanning AC confocal mikroskop, bredere tilgjengeligheten av skaden-induserende laser bølgelengder, og forbedringer i fluorescerende proteiner de siste 25 årene har gitt forskerne med de forbedrede verktøyene for å undersøke dette aspekter av DNA reparasjon, gjennom målrettet DNA skade induksjon.
Bestråling av celler med laser microbeams for å studere mobilnettet og subcellular er et veletablert verktøy i cellen og stråling biologi3. Bruk av denne teknikken til studier av DNA-reparasjon dukket opp når Cremer og kolleger brukt en svært fokusert UV (257 nm) laser microbeam systemet å indusere DNA skade over en 0,5 µm i kinesisk hamster eggstokk (CHO) celler4 og etablerte induksjon av DNA photolesions av denne system5. Mens tilbyr betydelige forbedringer over UV microbeam metoder samtidig, adopsjon av dette skade system var begrenset sin spesialisert sett opp og dens manglende evne til å generere bryter Dobbel-strand (DSBs)6. Påfølgende undersøkelser av en rekke UV-B (290-320 nm) og UV-en (320-400 nm) bølgelengder av flere grupper avslørt at UV photoproducts, oksidativt base lesjoner, enkelt strand bryter (SSBs), og DSBs kan bli indusert avhengig av laser bølgelengde og makt brukt4,7,8,9,10 (omtalt i 3). Videre ble kombinasjoner av disse UV-B og UV-A bølgelengder med sensitiverende agenter, som legge psoralen, bromodeoxyuridine (BrdU) og Hoechst fargestoffer, også funnet for å indusere DNA skade avhengig bølgelengde, kraft og varigheten av eksponering, men kraften måtte indusere skade senkes ofte i nærvær av disse agenter11,12,13,14,15. Disse truslene utvidet bruk av mikro-bestråling, selv om det var fortsatt teknisk hurdles tas for bredere adopsjon av disse metodene.
Cremer og kolleger i betydelig grad fremmet innen mikro-bestråling ved å fokusere presist UV-microbeam for å bruke betydelig skade energi over et svært lokaliserte område i cellen. AC confocal mikroskop og laser microdissection systemer avansert, var tett fokusert lys mer generelt tilgjengelig; imidlertid presentert koble UV kilder til omfang og håndtere kromatiske avvik de indusert fortsatt betydelige utfordringer til de fleste brukere3,6,16. Som UV fargestoffer økt i popularitet på 1990-tallet, optikk kan fokusere og fange UV-spent fluorescens ble mer utbredt16, og forbedringer i laserskanning tilbys brukere fokusert muligheten til å lage svært UV eksitasjon steder innenfor cellene6,17. Men det var ikke før tidlig på 2000-tallet at følte den sanne effekten av denne kombinasjonen av tett fokusert bjelker med høyere intensitet lasere, når mange rapporter dukket opp demonstrere at DNA strand bryter kan bli indusert med og uten allergifremkallende stoffer i den UV-A området6,10,18,19,20, 405 nm21,22,23,24, 25,26, og enda lenger synlig bølgelengder som 488 nm27. Disse truslene tillatt for mer utbredt bruk av mikro-bestråling teknikken på en rekke kommersielle systemer. Parallelt med denne utviklingen, to-fotonet teknikker også dukket opp som tillater presis induksjon av DNA skade; om disse truslene ikke vil bli omtalt her, er det en rekke gjennomgang artiklene diskuterer disse metoder9,28,29,30.
Med gjeldende tilgjengelighet av AC confocal mikroskop kan levere svært fokusert UV lys og utbredt tilgjengeligheten av fluorescerende proteiner tillate sanntidssporing av DNA reparasjon proteiner, mikro-bestråling teknikker har utviklet seg til kraftige verktøy for å undersøke DNA skade svar og reparere trasé. Brukere må imidlertid være klar over at generasjonen av DNA skade er svært avhengig av laser bølgelengde og makt på sub kjernefysiske regionen. Bruk av UV-C (~ 260 nm) bølgelengder tillate direkte DNA eksitasjon og høy selektivitet for induksjon av UV photoproducts7,8. UV-B og UV-A bølgelengder produserer blandinger av DNA skade (base lesjon, SSBs og DSBs), avhengig av brukte makt og mobilnettet bakgrunnen utnyttet7. Endogene photosensitizers og antioksidant nivåer i målrettede cellene kan påvirke DNA skade blandinger produsert av disse bølgelengder. I tillegg, kan bruk av ytre photosensitizers (BrdU, etc.) bistå i senke energien som trengs for induksjon av DNA skade. Men disse agentene kan indusere DNA skade seg selv, og de kan endre i cellen syklus og chromatin struktur, slik bruk kan gi uønskede effekter som må vurderes av brukeren. Derfor før du bruker micro-bestråling for å studere DNA skade respons og reparasjon, er nøye vurdering av DNA repair pathway interesse, bølgelengdene tilgjengelig for bruk og DNA skade blandingen opprettet nødvendig.
Her laser mikro-bestråling utføres på to brukte bølgelengder, 355 nm og 405 nm, uten allergifremkallende stoffer å demonstrere blandinger av DNA skade forårsaket av disse bølgelengder og påvirkninger disse skade blandinger har på å undersøke reparasjon avSSBs og DSBs.-brukere bør være klar over at disse bølgelengder ikke Opprett én art strand bryter eller base lesjoner. For å skille mellom DNA reparasjon veier, må brukere nøye kontroll brukte makt over et bestemt område av kjernen og karakterisere indusert skaden bruke flere strand pause markører og DNA lesjon antistoffer. Hvis riktig brukt og preget, kan laser mikro-bestråling berike noen arter av DNA skade, tillater brukernes å vurdere reparasjon av base lesjoner og SSBs eller DSBs, med noen spesifisitet. Derfor har vi gitt en metode som tillater brukere å reproduserbar utføre laser mikro-bestråling karakterisere DNA skade blandinger av brukt laser dose og analysere data.
Bruke forholdene beskrevet her, kan noen AC confocal mikroskop med en UV-A eller 405 nm laser, integrert av produsenten eller lagt til av sluttbrukeren, indusere DNA skade i kjernen av en celle og la rekruttering av DNA reparasjon proteiner til området av indusert DNA skade som skal overvåkes. Brukes imidlertid makt, som nevnt i protokollen og representant resultater, valg av bølgelengde og skade karakteristikk er alle viktige spørsmål som må tas først av brukeren for å studere en bestemt DNA reparasjon veien. I tillegg er det andre hensyn i eksperimentell design som må også vurderes av brukere.
For å overvåke et protein atferd i lever celler innlegg mikro-bestråling, en fluorescently merket protein må opprettes. Tilgjengeligheten av en rekke fluorescerende proteiner som kan skilles spectrally tilbyr verktøy for å lage protein fusjoner som benyttes for å karakterisere mobilnettet Svar å induksjon av DNA skade. Forbigående transfection fluorescerende proteiner rundt tillater rask screening av skadelige forhold, mutasjoner eller selv hemmere, stabilt transfekterte celler kan tilby mer kontroll over uttrykk nivåer og tillate andre biokjemiske karakteristikkene som skal utføres, validere mikro-bestråling resultater. Spectrally distinkte fluorescerende proteiner kan også benyttes i samme celle overvåke interaksjoner mellom proteiner i den samme veien eller i ulike veier. Fluorescerende proteiner også eliminere behovet for spesifikke antistoffer for hver protein rundt og la levende celle overvåking av protein for lange perioder etter induksjon av skade.
Bruk av fluorescerende proteiner har imidlertid også ulemper. Uten genetisk bakgrunn mangelfull i protein(s) rundt konkurrerer endogen proteiner med fluorescently merket proteiner. Bøyning av fluorescerende koden til N eller C endestasjonen til protein kan endre proteinfolding, hindre nøkkel protein-protein interaksjoner, eller blokkere translokasjon signaler; endre funksjon og potensielt påvirker rekruttering dynamikk. Disse effektene har vært vist i en rekke rapporter der immunofluorescent flekker vist dramatisk annerledes rekruttering og tid for endogene proteiner på skade nettstedet28. Bruk av forbigående transfection eller stabil kloner kan også endre svaret observert, vanligvis gjennom variasjoner i protein uttrykk nivå. Videre kan bruk av flere fluorescerende proteiner i et enkelt eksperiment også endre dynamikken i rekruttering, hvis protein nivå ikke er equilibrated godt eller rekruttering av større fluorescently-merket protein blokkerer rekrutteringen av andre proteiner . Til slutt, fluorescerende proteiner kan fungere som svak sensibilisering agenter, øker dannelsen av reaktive oksygen arter, og potensielt endre DNA skade blandinger indusert46,47. Til tross for disse ulempene tilbyr fluorescerende proteiner en rekke forskjellige fordeler i studere DNA reparasjon med mikro-bestråling og hvis brukere innlemme aktuelle kontroller, for eksempel skade karakterisering beskrevet her, kan de gi ny innsikt i skade respons og protein-protein interaksjoner3.
Om levende celle imaging ikke er nødvendig, kan immunofluorescence brukes til å overvåke svaret indusert skade. Innlegg skade induksjon og flekker med antistoffer spesifikke for proteiner og lesjoner av interesse, statiske øyeblikksbilder av skade induksjon og rekruttering og oppbevaring av reparasjon proteiner kan bygges ved å feste cellene til bestemte tider. Antistoffer kan brukes til å overvåke rekruttering av flere proteiner av renter og/eller post-translasjonell modifikasjoner av DNA skade responsen. Bruk av immunofluorescence eliminerer behovet for fluorescerende proteiner, og tillater endogene protein problemet undersøkes. Denne metoden har imidlertid også sine ulemper. Svært spesifikke antistoffer er nødvendig, og permeabilization og blokkerer prosedyrer må være optimalisert for å tillate oppdaging av rekruttering med tilstrekkelig signal intensitet. Fikse prosedyrene er ikke umiddelbar, og denne fysiske betingelsen begrenser timelige oppløsningen på denne tilnærmingen. Tilordne området av skade induksjon slik at cellene kan ligge igjen etter farging kan også vise betydelige utfordringer. AC confocal mikroskopet brukt i dette arbeidet kan for avbildningsbasert registrering som beskrevet ovenfor, så skadede celler kan gjenopprettes med høy presisjon. Hvis scenen registrering eller etset coverglass ikke er tilgjengelig, gang investering involvert i gjør flytte celler uten scenen registrering, kombinert med den iboende forsinkelsen mellom skade induksjon og fotografert rekruttering, immunofluorescence skjemmende for noen brukere. Men vil den mest nøyaktige og fullstendige mikro-bestråling eksperimentell design inkludere slike tilnærminger parallelt med bruk av fluorescerende proteiner, som beskrevet i presentert protokollen.
Her, både levende celle bildebehandling og immunofluorescence til å vise nytten av laser mikro-bestråling. Immunofluorescent flekker tillater oss å undersøke nøyaktig blanding av DNA skade opprettet og rekruttering av proteiner av hver laser makt, som tillater oss å bedre tolke de observerte endringene på rekruttering og oppbevaring av XRCC1-GFP. Basert på disse resultatene, bør bruk av 405 nm lasere begrenses for undersøkelse av BER og SSBR proteiner. Videre den optimale eksperimentell designen inkluderer makt mål etter mål, full skade blanding karakterisering av hver celle linje som brukes og validering av rekruttering og oppbevaring observert i fluorescently merket proteiner med immunofluorescence. Selvfølgelig, utstyr, tid og kostnadsvurderinger kan gjøre disse optimal eksperimentell design umulig for noen brukere. Men betydningen av hvert av disse elementene er vist her, og brukere bør huske disse vurderingene på når du starter mikro-bestråling eksperimenter.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Dr. Samuel H. Wilson på National Institute of Environmental helse Sciences for cellen linjene i dette arbeidet.
Nikon A1rsi laser scanning confocal microscope | Nikon | ||
NIS Elements software | Nikon | ||
355 nm laser | PicoQuant VisUV | Radiation source | |
Galvanometer photoactivation miniscanner | Bruker | ||
Microscope slide photodiode power sensor | THORLabs | S170C | |
Fiber photodiode power sensor | THORLabs | S150C | |
Digital handheld optical power and energy meter | THORLabs | PM100D | |
CHO-K1 | From Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS | ||
Minimal essential media | Hyclone | SH3026501 | |
Fetal bovine serum | Atlanta biologicals | S11550 | |
XRCC1-GFP | Origene | RG204952 | |
Jetprime | Polyplus transfection | 11407 | |
Geneticin | ThermoFisher | 10131035 | |
4 chambered coverglass | ThermoFisher | 155382 | |
8 chambered coverglass | ThermoFisher | 155409 | |
Anti 53BP-1 | Novus | NB100304 | |
Anti-phospho-histone H2AX | Millipore | 05-636-I | |
Anti cyclobutane pyrimidine dimer | Cosmo Bio clone | CAC-NM-DND-001 | |
Anti 8-oxo-2´-deoxyguanosine | Trevigen | 4354-MC-050 | |
Alexa 488 goat anti-mouse | ThermoFisher | A11029 | |
Alexa 546 goat anti-rabbit | ThermoFisher | A11010 | |
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | R37606 | Caution toxic! |
Phosphate buffered saline | ThermoFisher | 0780 | |
Normal goat serum | ThermoFisher | 31873 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
37% Formaldehyde | ThermoFisher | 9311 | Caution toxic! |
Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
Methanol | VWR | BDH1135 | Caution toxic! |
HCl | Fisher | SA49 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Caution toxic! |
Tris Hydrochloride | Amresco | O234 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |