Konfokal Fluorescens mikroskopi og laser mikro-bestråling tilbyder værktøjer til inducerende DNA-skader og overvåge svaret fra DNA reparation proteiner i udvalgte sub nukleare områder. Denne teknik har betydeligt avancerede vores kendskab til skader påvisning, signalering og rekruttering. Dette manuskript viser disse teknologier for at undersøge enkelt og dobbelt strand bryde reparation.
Meget koordineret DNA reparation veje findes for at opdage, punktafgifter og Udskift beskadigede DNA-baser og koordinere reparation af DNA strand pauser. Mens molekylærbiologiske teknikker har afklaret struktur, enzymatiske funktioner og kinetik af reparation proteiner, er der stadig behov for at forstå, hvordan reparation er koordineret i kernen. Laser mikro-bestråling tilbyder et stærkt værktøj til inducerende DNA-skader og overvågning ansættelse af reparation proteiner. Induktion af DNA skader ved laser mikro-bestråling kan forekomme med en vifte af bølgelængder, og brugere kan pålideligt fremkalde enkelt strand pauser, base læsioner og dobbelt strand bryder med en række doser. Her, laser mikro-bestråling bruges til at undersøge reparation af enkelt og dobbelt strand pauser induceret af to fælles Konfokal laser bølgelængder, 355 nm og 405 nm. Yderligere, rette karakterisering af den anvendte laser dosis for at fremkalde bestemte skader blandinger er beskrevet, så brugere kan reproducerbar udføre laser mikro-bestråling dataopsamling og analyse.
Fluorescerende mikroskopi er opstået som en kraftfuld teknik til at visualisere cellulære arkitektur, undersøge protein lokalisering og overvågning af protein-protein og protein-DNA interaktioner. Brug af fluorescerende mikroskopi til at studere DNA skader svar efter anvendelsen af globale DNA skadelige agenser, såsom ultraviolet (UV) lys, har ioniserende stråling, kemiske oxidationsmidler eller alkylerende stoffer, og/eller kemoterapeutika givet ny indsigt i indledning, signalering og rekruttering af DNA reparere proteiner til websteder af DNA skade1,2. Men disse globale og asynkron ødelæggende begivenheder er begrænsende, hvis detaljerede oplysninger om rekruttering ordre, kinetik af association og dissociation, og relationer mellem centrale DNA reparation proteiner er søgt. Heldigvis har fremskridt i laser scanning Konfokal mikroskoper, bredere tilgængelighed af skader-inducerende laser bølgelængder, og forbedringer i fluorescerende proteiner i de sidste 25 år har givet forskere med forbedrede værktøjer til at undersøge disse aspekter af DNA reparation, gennem målrettede DNA skader induktion.
Bestråling af celler med laser microbeams for at studere cellulært og subcellulært funktioner er et veletableret redskab i celle og stråling biologi3. Anvendelse af denne teknik til undersøgelse af DNA reparation fremgik når Cremer og kollegaer brugt en meget fokuseret UV (257 nm) laser microbeam system til at fremkalde DNA-skader over en 0,5 µm spot i kinesisk hamster ovarie (CHO) celler4 og etableret induktion af DNA photolesions ved dette system5. Mens tilbyder betydelige forbedringer over UV microbeam metoder på tidspunktet, vedtagelsen af denne skadelige system var begrænset på grund af dens specialiseret sæt op, og dens evne til at generere bryder dobbeltstrenget (DSBs)6. Efterfølgende undersøgelse af en række UV-B (290-320 nm) og UV-en (320-400 nm) bølgelængder af en række grupper afslørede at UV photoproducts, oxidativ basere læsioner, enkelt streng bryder (SSBs), og DSBs kunne være fremkaldt afhængig af laser bølgelængde og magten anvendes4,7,8,9,10 (revideret i 3). Yderligere, kombinationer af disse UV-B og UV-A bølgelængder med sensibiliserende stoffer, som psoralen, bromodeoxyuridine (BrdU) og Hoechst farvestoffer, blev også konstateret for at inducere DNA skader afhængig af bølgelængde, magt og varigheden af eksponering, selvom strømmen skulle fremkalde skader er ofte sænket i nærværelse af disse agenter11,12,13,14,15. Disse fremskridt udvides brugen af mikro-bestråling, men der var stadig tekniske forhindringer skal behandles for bredere anvendelse af disse metoder.
Cremer og kollegaer betydeligt avancerede inden for mikro-bestråling ved netop at fokusere UV microbeam for at anvende betydelige skadelige energi over et stærkt lokaliseret område i cellen. Som Konfokal mikroskoper og laser microdissection systems avancerede, blev stramt fokuseret lys mere bredt tilgængelige; dog præsenterede kobling UV kilder til anvendelsesområder og beskæftiger sig med den kromatiske aberration de induceret stadig betydelige udfordringer til de fleste brugere3,6,16. Som UV farvestoffer steget i popularitet i hele 1990 ‘ erne, optik i stand til at fokusere og fanger UV-spændt fluorescens blev mere bredt tilgængelige16og forbedringer i laser scanning tilbydes brugerne fokuseret mulighed for at skabe meget UV excitation steder inden for celler6,17. Men det var ikke indtil de tidlige 2000 ‘er at den reelle virkning af denne kombination af stramt fokuseret bjælker med højere intensitet lasere mente, når talrige rapporter opstået demonstrerer, at DNA strand pauser kan induceres med og uden sensibiliserende i den UV-A range6,10,18,19,20, 405 nm21,22,23,24, 25,26, og selv ved længere synlige bølgelængder som 488 nm27. Disse fremskridt er tilladt for mere udbredt anvendelse af mikro-bestråling teknik på en række kommercielle systemer. Parallelt med denne udvikling opstod to-foton teknikker også der tillod præcis induktion af DNA skade; Selvom disse fremskridt ikke vil blive diskuteret her, er der en række review artikler diskuterer disse metoder9,28,29,30.
Med den aktuelle tilgængelighed af Konfokal mikroskoper kan levere meget fokuseret UV-lys og udbredt tilgængelighed af fluorescerende proteiner til at tillade sporing af DNA reparation proteiner i realtid, mikro-bestråling teknikker har udviklet sig til kraftfulde værktøjer til at undersøge DNA skader svar og reparation veje. Men brugerne skal være klar over, at generation af DNA-skader er meget afhængige af laser bølgelængde og kraften påføres de sub atomare område. Brug af UV-C (~ 260 nm) bølgelængder giver mulighed for direkte DNA excitation og høj selektivitet for induktion af UV photoproducts7,8. UV-B og UV-A bølgelængder producerer blandinger af DNA-skader (base læsion, SSBs og DSBs), afhængig af den anvendte kraft og cellulære baggrunden udnyttet7. Endogene photosensitizers og anti-oxidant niveauet i de målrettede celler kan påvirke DNA skader blandinger fremstillet af disse bølgelængder. Derudover kan brug af eksogene photosensitizers (BrdU, etc.) hjælpe til at sænke den energi, der kræves til induktion af DNA-skader. Men disse agenser kan fremkalde DNA-skader sig selv, og de kan ændre cellecyklus og kromatin struktur, så deres anvendelse kan producere uønskede virkninger, der skal overvejes af brugeren. Derfor, før du bruger mikro-bestråling for at studere DNA skader svar og reparation, nøje overvejelse af DNA reparation pathway, de bølgelængder, der er tilgængelige til brug, og DNA skader blanding lavet er påkrævet.
Her, laser mikro-bestråling er udført på to almindeligt anvendte bølgelængder, 355 nm og 405 nm, uden sensibiliserende at demonstrere blandinger af DNA-skader induceret af disse bølgelængder og den indflydelse, disse skader blandinger have på behandlingen reparation afSSBs og DSBs. brugerne skal være klar over, at disse bølgelængder ikke skaber en enkelt art af strand pauser eller base læsioner. For at skelne mellem DNA repair veje, skal brugerne omhyggeligt kontrollere anvendt magt over en specifik region af kernen og karakterisere den inducerede skader ved hjælp af flere strand bryde markører og DNA læsion antistoffer. Hvis korrekt anvendt og karakteriseret, kan laser mikro-bestråling berige nogle arter af DNA-skader, tillade brugernes hen til vurdere reparation af base læsioner og SSBs eller DSBs, med nogle specificitet. Derfor har vi fastsat en metode, tillade brugernes hen til reproducerbar udføre laser mikro-bestråling, karakterisere DNA skader blandinger induceret af den anvendte laser dosis, og udføre dataanalyse.
Bruger betingelserne beskrevet her, kan enhver Konfokal mikroskop med en UV-A eller 405 nm laser, enten integreret af fabrikanten eller tilføjet af slutbrugeren, fremkalde DNA skader inden for kernen i en celle og tillade ansættelse af DNA reparation proteiner til stedet for induceret DNA skader kan overvåges. Men, som anført i protokollen og repræsentative resultater, bølgelængde udvælgelse, anvendes magt, og skader karakterisering er alle vigtige spørgsmål, som skal behandles først af brugeren for at studere en bestemt DNA reparation pathway. Derudover er der andre overvejelser i eksperimentelle design, der skal også tages i betragtning af brugere.
For at overvåge en protein adfærd i levende celler post mikro-bestråling, en fluorescently mærket protein skal oprettes. Tilgængeligheden af en bred vifte af fluorescerende proteiner, der kan adskilles spektralt tilbyder værktøjer til at skabe protein fusioner, der kan anvendes til karakterisering af cellulære svar til induktion af DNA-skader. Forbigående Transfektion af fluorescerende proteiner af interesse giver mulighed for hurtig screening af skadelige betingelser, mutationer eller endda hæmmere, mens stabilt transfekteret celler giver mere kontrol over udtryk niveauer og giver mulighed for andre biokemiske beskrivelser skal udføres, validering af mikro-bestråling resultater. Spektralt forskellige fluorescerende proteiner kan også udnyttes i den samme celle til at overvåge interaktioner mellem proteiner inden for den samme sti eller i forskellige veje. Fluorescerende proteiner også fjerne behovet for specifikke antistoffer for hvert protein af interesse og give mulighed for levende celle overvågning af protein opførsel i lang tid efter induktion af skader.
Brug af fluorescerende proteiner har dog også ulemper. Uden genetiske baggrunde mangelfuld i de(n) af interesse, vil endogene proteiner konkurrere med fluorescently mærket proteiner. Konjugation af fluorescerende tag til N eller C endestation for proteinet kan ændre proteinfoldning, hindre vigtige protein-protein interaktioner eller blokere translokation signaler; ændre funktion og potentielt påvirker rekruttering dynamics. Disse virkninger er blevet påvist i en række rapporter hvor immunfluorescent farvning demonstreret dramatisk anderledes rekruttering og retentionstiderne for endogene proteiner på skade site28. Brug af forbigående Transfektion eller stabil kloner kan også ændre svar observeret, typisk gennem variationer i protein udtryk niveauer. Yderligere, brugen af flere fluorescerende proteiner i en enkelt eksperiment kan også ændre dynamikken i rekruttering, hvis protein niveauer ikke er ekvilibreres godt eller ansættelse af de større fluorescently markeret protein blokerer ansættelse af andre proteiner . Endelig, fluorescerende proteiner kan fungere som svage sensibilisering agenter, øge dannelsen af reaktive ilt arter, og potentielt ændre DNA skader blandinger induceret46,47. Trods disse ulemper tilbyder fluorescerende proteiner en række forskellige fordele i at studere DNA reparation med mikro-bestråling, og hvis brugerne indarbejde hensigtsmæssige kontrolforanstaltninger, som skader karakterisering beskrevet her, de kan give ny indsigt i skader svar og protein-protein interaktioner3.
Hvis der ikke kræves levende celle imaging, kan immunofluorescens bruges til at overvåge svar til induceret skade. Ved fastsættelse af celler på bestemte tidspunkter efter skader induktion og farvning med antistoffer specifikke for proteiner og læsioner af interesse, statisk snapshots af skader induktion og rekruttering og fastholdelse af reparation proteiner kan bygges. Antistoffer kan bruges til at overvåge ansættelse af flere proteiner af renter og posttranslationelle modifikationer induceret af DNA skade svar. Brug af immunofluorescens eliminerer behovet for fluorescerende proteiner, og giver mulighed for endogene protein adfærd undersøges. Denne metode har imidlertid også sine ulemper. Meget specifikke antistoffer er nødvendige, og permeabilization og blokerende procedurer skal optimeres for at muliggøre påvisning af ansættelse med tilstrækkeligt signal intensitet. Fastsættelse af procedurer er ikke øjeblikkelig, og denne fysiske begrænsning begrænser den tidsmæssige opløsning af denne fremgangsmåde. Kortlægning stedet for skader induktion, så cellerne kan findes igen efter farvning kan også præsentere væsentlige udfordringer. Konfokal mikroskop bruges i dette arbejde giver mulighed for image-baseret registrering som beskrevet ovenfor, så beskadigede celler kan flyttes med høj præcision. Hvis scenen registrering eller ætset daekglas ikke er tilgængelig, den tid investeringer involveret i kan bufferzonen celler uden fase registrering, kombineret med den iboende forsinkelse mellem skader induktion og afbildet ansættelse, gøre immunfluorescens uattraktive for nogle brugere. Dog vil de mest nøjagtige og fuldstændige mikro-bestråling eksperimentelle design indarbejde disse typer af tilgange parallelt med brug af fluorescerende proteiner, som beskrevet i den præsenterede protokol.
Her, bruges både levende celle imaging og immunfluorescens til at påvise nytten af laser mikro-bestråling. Immunfluorescent farvning gør det muligt for os præcist undersøge blanding af DNA skade lavet og ansættelse af proteiner induceret af hver laser power, som giver os mulighed for bedre at kunne fortolke de observerede ændringer i rekruttering og fastholdelse af XRCC1-normal god landbrugspraksis. Baseret på disse resultater, bør brugen af 405 nm lasere være begrænset til undersøgelse af BER og SSBR proteiner. Yderligere, den optimale eksperimentelle design ville omfatte magt målinger efter målet, en fuld skader blanding karakteristika for hver cellelinje bruges og validering af rekruttering og fastholdelse observeret i fluorescently mærkede proteiner med immunfluorescens. Selvfølgelig, udstyr, tid og omkostninger overvejelser kan umuliggøre disse optimale eksperimentelle design for nogle brugere. Men betydningen af hvert af disse elementer er vist her, og brugere bør holde disse overvejelser i tankerne ved starten af mikro-bestråling eksperimenter.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Dr. Samuel H. Wilson på National Institute of miljømæssige sundhed Sciences for cellelinjer bruges i dette arbejde.
Nikon A1rsi laser scanning confocal microscope | Nikon | ||
NIS Elements software | Nikon | ||
355 nm laser | PicoQuant VisUV | Radiation source | |
Galvanometer photoactivation miniscanner | Bruker | ||
Microscope slide photodiode power sensor | THORLabs | S170C | |
Fiber photodiode power sensor | THORLabs | S150C | |
Digital handheld optical power and energy meter | THORLabs | PM100D | |
CHO-K1 | From Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS | ||
Minimal essential media | Hyclone | SH3026501 | |
Fetal bovine serum | Atlanta biologicals | S11550 | |
XRCC1-GFP | Origene | RG204952 | |
Jetprime | Polyplus transfection | 11407 | |
Geneticin | ThermoFisher | 10131035 | |
4 chambered coverglass | ThermoFisher | 155382 | |
8 chambered coverglass | ThermoFisher | 155409 | |
Anti 53BP-1 | Novus | NB100304 | |
Anti-phospho-histone H2AX | Millipore | 05-636-I | |
Anti cyclobutane pyrimidine dimer | Cosmo Bio clone | CAC-NM-DND-001 | |
Anti 8-oxo-2´-deoxyguanosine | Trevigen | 4354-MC-050 | |
Alexa 488 goat anti-mouse | ThermoFisher | A11029 | |
Alexa 546 goat anti-rabbit | ThermoFisher | A11010 | |
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | R37606 | Caution toxic! |
Phosphate buffered saline | ThermoFisher | 0780 | |
Normal goat serum | ThermoFisher | 31873 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
37% Formaldehyde | ThermoFisher | 9311 | Caution toxic! |
Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
Methanol | VWR | BDH1135 | Caution toxic! |
HCl | Fisher | SA49 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Caution toxic! |
Tris Hydrochloride | Amresco | O234 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |