Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Johannes Hemmerich; Lars Freier; Wolfgang Wiechert; Eric von Lieres; Marco Oldiges

doi:10.3791/56234

JoVE Journal > Bioengineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

생체공학

Generic-Protocol voor optimalisatie van heterologe eiwitproductie met behulp van geautomatiseerde Microbioreactor technologie

Published: December 15, 2017

doi:

10.3791/56234

Johannes Hemmerich*^1,2, Lars Freier*^1,2, Wolfgang Wiechert^1,2,3, Eric von Lieres^1,2, Marco Oldiges^1,2,4

¹IBG-1: Biotechnology,Forschungszentrum Jülich, ²Research Center Jülich,Bioeconomy Science Center (BioSC), ³Computational Systems Biotechnology (AVT.CSB),RWTH Aachen University, ⁴Institute for Biotechnology,RWTH Aachen University

Summary

Dit manuscript beschrijft een algemene aanpak voor op maat gemaakte ontwerp van microbiële teelt media. Deze optie is ingeschakeld door een iteratieve werkstroom combineren Kriging gebaseerde experimentele design en microbioreactor technologie voor voldoende teelt doorvoer, die wordt ondersteund door lab robotica om betrouwbaarheid en snelheid in vloeistof behandeling van media voorbereiding.

Abstract

Een corebusiness in industriële biotechnologie met behulp van microbiële productie cel fabrieken is het iteratieve proces van stam engineering en optimalisatie van Bioprocestechnologie voorwaarden. Een belangrijk aspect is de verbetering van de teelt medium om te zorgen voor een optimale omgeving voor microbiële vorming van het product van belang. Het is ook aanvaard dat de media samenstelling dramatisch algemene Bioprocestechnologie prestaties kan beïnvloeden. Voeding middellange optimalisatie is bekend om recombinant eiwit productie met microbiële systemen en dus dit is een veelbelovende stap in Bioprocestechnologie ontwikkeling. Echter zijn vaak standaard media recepten afkomstig uit de literatuur, aangezien op maat gemaakt ontwerp van het medium van de teelt is een vervelende taak die microbioreactor technologie voor voldoende teelt doorvoer, snelle product analytics, evenals ondersteuning vereist door lab robotica om betrouwbaarheid in vloeistof verwerken stappen. Bovendien, geavanceerde wiskundige methoden zijn vereist voor rationeel analyseren van meetgegevens en efficiënt ontwerpen van parallelle experimenten zoals te bereiken optimale informatie-inhoud.

De algemene aard van het gepresenteerde protocol voorziet in gemakkelijke aanpassing aan verschillende lab-apparatuur, andere expressie hosts en doel proteïnen van belang, evenals verdere Bioprocestechnologie parameters. Bovendien kunnen andere optimalisatie doelstellingen zoals eiwit productieomvang, specifieke opbrengst of kwaliteit van de producten worden gekozen aan de werkingssfeer van andere studies voor optimalisatie. De toegepaste Kriging Toolbox (KriKit) is een algemene tool voor ontwerp van experimenten (DOE) die aan betere holistische Bioprocestechnologie optimalisatie bijdraagt. Het ondersteunt ook multi objectieve optimalisering die kan van belang in het optimaliseren van processen van zowel upstream- en downstream.

Introduction

Moderne recombinante gentechnologie maakt het breed gebruik van technische enzymen voor diverse toepassingen in de farmaceutische industrie, diervoeding, organische chemie, en voedselverwerking¹^,²^,³. De productie van technische enzymen in grote hoeveelheden is een belangrijk onderwerp voor de industriële biotechnologieën en voor geoptimaliseerde recombinante eiwitproductie, en beide stam en bioprocess engineering is nodig. Voor de generatie van efficiënt gemanipuleerde productie stammen, verschillende genetische bibliotheken zijn beschikbaar, bijvoorbeeldvoor evenwichtige gen expressie⁴ of verhoogde secretie efficiëntie⁵.

Corynebacterium glutamicum is een belangrijke producent van aminozuren op de industriële schaal⁶^,⁷ en vertegenwoordigt een aantrekkelijke niet-conventionele expressie gastheer voor de secretoire productie van recombinante eiwitten⁸ ^,⁹. Zowel de algemene secretoire (Sec) en de tweeling-arginine translocatie (Tat) traject zijn aanwezig in C. glutamicum en werden met succes toegepast voor recombinante eiwitten secretie¹⁰. Uitgebreide ervaring in bioprocess engineering met betrekking tot aminozuur productie op de industriële schaal, evenals de mogelijkheid om eiwitten g/L bedragen¹¹ te grote robuustheid betreffende Bioprocestechnologie inhomogeneities gevonden in grootschalige afscheiden teelten¹²^,¹³, maken C. glutamicum een veelbelovende platform organisme voor de secretoire productie van heterologe eiwitten op de industriële schaal.

Voeding middellange optimalisatie is bekend om de productie van recombinante eiwitten met microbiële systemen¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷ , en bijgevolg, de aanpassing van medium samenstelling is een veelbelovende stap in Bioprocestechnologie ontwikkeling met betrekking tot optimale productiviteit¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹. Intens onderzoek betreffende de toepassing van de microtiterplaat platen (MTPs) voor microbiële teelt²²^,²³^,²⁴ baande de weg voor de ontwikkeling en het ontwerp van MTPs voor microbiële teelt²⁵ ^,²⁶ en de ontwikkeling van MTP gebaseerde microbioreactor (MBR) systemen met online monitoring en milieu controle²⁷^,²⁸. MBRs kunnen een aanzienlijke toename van de experimentele teelt doorvoer. Bovendien, MBR systemen als gevolg van andere soorten bioreactoren, bijvoorbeeld, bubble kolommen of stirred tank reactoren, zijn beschikbaar voor microbiële Bioprocestechnologie optimalisatie²⁹^,³⁰^,³¹^, ³².

In het algemeen, profiteren optimalisatie studies van verhoogde experimentele doorvoer, die wordt nog krachtiger in combinatie met DOE methodologieën, zodanig beoordelen van interacties tussen ontwerp-variabelen of verminderen van hoge-dimensionale Zoek ruimten. Bijgevolg, het gecombineerd gebruik van MBR systemen, lab automatisering en DOE is gebleken een krachtige methode in biotechnologie⁸^,¹⁶^,³³^,³⁴^,³⁵.

Een protocol voor media optimalisatie wordt gepresenteerd voor het combineren van state-of-the-art lab automatisering, MBR technologie met online proces monitoring en analyse/experimentele design Kriging gebaseerde gegevens. De methodologie van de Kriging is geïmplementeerd in een MATLAB Toolbox (“KriKit”) die kunnen worden gedownload en gebruikt gratis voor de gratis³⁶. Als de toepassing bijvoorbeeld is de maximalisatie van secretoire groene ﬂuorescent proteïne (GFP) productie met C. glutamicum komt te staan door het optimaliseren van de samenstelling van de CgXII minimaal medium. GFP titer werd gekozen als de doelstelling optimalisatie als het gemakkelijk kan worden gekwantificeerd en algemeen als model eiwit voor studies over MBR systemen³⁷^,³⁸^,^{39 toegepast wordt}.

Het voorgestelde kader is verdeeld in vier stappen, die zijn aangegeven in Figuur 1. De stappen worden aangegeven door vak frames en corresponderen met de secties van het protocol. De eerste stap (figuur 1A) is om de doelen van het project definiëren en bepalen welke vereiste methoden. De combinatie van DOE methodologieën, MBR technologie en lab automatisering een doorvoersnelheid kan verhoogd experimentele die vraagt om krachtige gegevensverwerking. De tweede stap (figuur 1B) is gericht op het detecteren van gevoelige ontwerp variabelen (d.w.z., middellange onderdelen) met hoge invloed op de doelstelling van de optimalisatie. Dit leidt tot een verminderd aantal ontwerp van belang zijnde variabelen. De derde stap (Figuur 1 c) bestaat uit een iteratief optimalisatie voor een meer gedetailleerd onderzoek van de functionele relatie tussen de overige ontwerp-variabelen en de doelstelling van belang. Met behulp van de achtereenvolgens uitgebreide gegevensset, wordt de Kriging benadering toegepast voor het voorspellen van de experimentele resultaten op zonder afmetingen locaties. De iteratieve cyclus stopt zodra het Kriging model een optimale of plateau met voldoende nauwkeurigheid voorspelt. De resultaten worden bevestigd in de vierde stap (Figuur 1 d), beginnend met een nadere gevoeligheidsanalyse rond de geïdentificeerde optimale. Als aanvankelijk ongevoelig onderdelen zijn ook ongevoelig worden de optimale regio, is het redelijk te veronderstellen dat dit tijdens de iteratieve optimalisatie-procedure in de derde stap geldt. Daarna wordt het geadviseerd om te controleren of optimalisatie resultaten door toepassing van orthogonale methoden, zoals een bepaling van de activiteit of de SDS-pagina.

De algemene aard van het gepresenteerde protocol voorziet in gemakkelijke aanpassing aan verschillende lab-apparatuur, andere expressie hosts en doel proteïnen van keuze, evenals verdere Bioprocestechnologie variabelen zoals pH waarde of teelt temperatuur.Bovendien kunnen andere optimalisatie doelstellingen zoals eiwit productieomvang, specifieke opbrengst of kwaliteit van de producten worden gekozen aan de werkingssfeer van andere studies voor optimalisatie.

Figuur 1 : Workflow optimalisatie studie. De vier frame vakken komen overeen met delen van het protocol, “Conceiving de studie en definitie van Methods” (deel 1), “Sensitivity Analysis” (sectie 2), “Iteratieve Optimization” (sectie 3) en “Validatie” (punt 4). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Protocol

1. het concipiëren van de studie en de definitie van methoden (Figuur 1: deel A) Opmerking: Definitie van de optimalisatie-doelstelling: een tijdsverloop van productvorming nodig Is of slechts een beperkte tijdsinterval of zelfs een vast tijdstip geldt? Potentiële problemen zoals stabiliteit, inspanning of analytische kwantificering, teeltduur is ook belangrijk. Als alternatief voor definitieve eiwit titer, worden andere doelstellingen zoals biomassa of teelt tijd overwogen. Biomassa wordt weerspiegeld door biomassa specifiek product rendement, terwijl teeltduur wordt weerspiegeld door ruimte-tijd-rendement. De kwaliteit van de producten van de (minimum) zou ook een doel. Multi objectieve optimalisatie kan worden verplicht in bepaalde situaties, zoals besproken elders40. In deze studie, GFP titer na 17u voor teelt werd gekozen als de doelstelling van de optimalisatie. GFP fluorescentie kan online met behulp van de apparatuur beschikbaar in deze studie, die sterk vereenvoudigt de bepaling van de concentratie van het eiwit model worden gevolgd.Opmerking: Definitie van de parameters worden geoptimaliseerd: CgXII medium bestaat uit 16 afzonderlijke onderdelen41 en onderzoeken van al deze in een volledige faculteit ontwerp zou resulteren in 216 ≈ 65.000 experimenten. Bijgevolg moet de zoekruimte worden verminderd op basis van rationele en ervaring-gedreven. De selectie van media-onderdelen voor optimalisatie beschouwd kan worden ondersteund door de beschikbare expert kennis of literatuur gegevens. Beslissen welke concentraties middellange component moeten niet worden gevarieerd. Voor de optimalisatie van CgXII medium, werden de volgende onderdelen gekozen vast te stellen: Glucose wordt vastgesteld op 10 g/L. Deze optimalisatie is triviaal omdat meer glucose levert meer GFP afscheidende biomassa. Het doel was om niet-intuïtieve middelgrote effecten zichtbaar te maken. 3-(N-morfolino) propanesulfonic zuur (MOPS) is vastgesteld op 42 g/L. Dit biedt voldoende buffercapaciteit tijdens batch teelt en wordt niet gemetaboliseerd.Opmerking: De toevoeging van MOPS op deze eindconcentratie zorgt voor een waarde voor de beginkleur van pH 7, zelfs met de verschillende volumes van de andere voorraadoplossingen toegevoegd, die niet met een pH van 7. Echter, als u wilt uitsluiten van afwijkingen in het starten van pH-waarden, de pH moet worden gecontroleerd op middellange composities waar alle stamoplossingen worden toegevoegd aan hun maximale en minimale hoeveelheden. KH2PO4 en K2HPO4 zijn vastgesteld op 1 g/L elke. Deze bieden ook buffercapaciteit en fungeren als een bron van fosfaat. Ureum is vastgesteld op 5 g/L. Dit dient als een basale stikstofbron en pH-stabiliseren agent, voldoende om te voorkomen van N-beperking. Biotine is vastgesteld op 0,2 mg/L. C. glutamicum ATCC13032 is auxotrofe voor biotine. Protocatechuic zuur (PCA) bedraagt 30 mg/L. Het dient als een strijkijzer chelaat agent. Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) is vastgesteld op 100 µM. Het induceert de uitdrukking van het gfp -gen. Selecteer hoge en lage concentraties van media-onderdelen voor eerste gevoeligheid screenings. Hier, werden componenten van drie typische soorten mediacomponenten gekozen. De onderzochte lage en hoge concentraties voor elk onderdeel zijn: Standaard stikstofbron: (NH4)2SO4 (8-32 g/L); de variatie van de stikstofbron werd gemeld te zijn veelbelovend voor optimalisatie van biomassa-specifieke GFP signaal8. Sporenelementen: FeSO4 ∙ 7 H2O (4-16 mg/L), MnSO4 ∙ H2O (4-16 mg/L), ZnSO4 ∙ 7 H2O (0.4-1,6 mg/L), CuSO4 ∙ 5 H2O (125-501 µg/L), NiCl2 ∙ 6 H2O () 8-32 µg/L) en CoCl2 ∙ 6 H2O (52-208 µg/L). De samenstelling van sporenelementen wordt overgenomen uit de eerste publicatie van CgXII middellange41. Bovendien, Na2MoO4 ∙ H2O (26-104 µg/L) en H3BO3 (20-80 µg/L) werden opgenomen als sporenelementen, aangezien zij worden gebruikt in een gepubliceerde variant van middellange CgXII42. Macro-elementen: MgSO4 ∙ 7 H2O (0,2-0,4 g/L), CaCl2 ∙ 2 H2O (5.3-21,2 mg/L). Deze bleken onder andere divalente kationen te verbeteren secretoire GFP productie in een andere studie14, waar de stam van C. glutamicum R werd gebruikt met een andere middellange achtergrond en de CgR0949 Tat signaal peptide. Voorbereiding van materialen en methoden van de definitieOpmerking: Het wordt aangeraden te definiëren en op te lossen van de experimentele methoden op een gedetailleerd niveau. Deze standaardisatie zorgt ervoor dat verschillende resultaten kunnen worden getraceerd naar intrinsieke biologische variabiliteit of verschillende middellange composities.Opmerking: Media voorraad oplossingen: individuele stamoplossingen voorbereiden op alle mediacomponenten onderzocht. Sterk geconcentreerde voorraden te voorzien in de verdunning van verschillende volumes voor alle componenten voor te bereiden. Dit betekent dat na combineren alle stamoplossingen op hun hoogste volume volgens het ontwerpplan, dit kan niet meer bedragen dan de uiteindelijke teelt volume, Zie paragraaf “Generatie van middellange stockoplossing pipetting lijst” stap 1.3.3. Als de toevoeging van een sterk geconcentreerde oplossing in een zeer lage toevoeging volume, b.v. resulteert < 1/100,th van het volume van de definitieve teelt, Verdun de stockoplossing dienovereenkomstig. In deze studie werd een pipetting volume van minder dan 10 µL bijvoorbeeld gedefinieerd als onhaalbaar. Spoorelement oplossingen zijn meestal geconcentreerd zo hoog als 1,000fold met betrekking tot standaard eindconcentratie in het medium. Is het voordelig te concentreren mediacomponenten als veelvouden (X-fold) met betrekking tot concentraties in het referentie-recept. Door dit te doen, worden onbruikbare pipetting volumes van fractionele decimalen vermeden. Gedetailleerde recepten voor alle stamoplossingen van CgXII medium worden gegeven in het aanvullend document. Werkende cel bank (WCB)Opmerking: Voor elk experiment groei, één WCB aliquoot wordt gebruikt. Als meer aliquots nodig zijn, gebruik 100 mL hersenen hart infusie (BHI) medium in 1000 mL verbijsterd schudden kolven of meerdere shake kolven, die zijn samengevoegd voordat de toevoeging van glycerol oplossing worden geënt. Enkele kolonies van de recombinante expressie stam C. glutamicum pCGPhoDBs- GFP43 op agar platen (37 g/L BHI poeder, 20 g/L agar, 25 mg/L kanamycine) voor te bereiden. Plating materiaal kan hetzij afkomstig van verse transformatie of een cryopreserved hoeveelheid.Incubeer bij 30 ° C tot het uiterlijk van één kolonies; Dit duurt meestal één tot twee dagen. Een shaker kolf cultuur (50 mL BHI medium met 25 mg/L kanamycine, verbijsterd kolf van 500 mL, 250 rpm, 25 mm diameter schudden, 30 ° C) met kolonie materiaal beënten en incuberen overnachting (ongeveer 16 h). Combineer volumedeel resulterende celsuspensie met volumedeel van oplossing van 500 g/L steriele glycerol en verdelen in 2 mL aliquots in steriele cryopreservatie flesjes. Winkel bij-80 ° C. Protocol van de teelt van de MBROpmerking: Voor de werknemer BioLector MBR-systeem in deze studie, verstrooid licht (biomassa) en GFP fluorescentie zijn intensiteit metingen, moeten een bepaalde winst waarde toegewezen. Hoe hoger de winst, hoe hoger het optische signaal wordt versterkt; Dit is ook waarom verstrooide licht en fluorescentie worden gemeten in willekeurige eenheden (a.u.). Geschikte winst waarden voor biomassa en GFP detectie in voorbereidende experimenten, samen met passende frequentie schudden en vullen volume Voorkom zuurstof beperking bij hogere concentraties van biomassa tijdens latere procesfasen te bepalen. De werknemer teelt voorwaarden (“Flowerplates”, dat wil zeggen, bloem-vormige 48-well MTPs, frequentie van 1.200 rpm, schudden vullen volume van 1.000 µL, 10 g/L glucose als belangrijkste koolstofbron) gewaarborgd zuurstof onbeperkt teelten. Voor maximale zuurstof overdrachtsnelheden die voortvloeien uit andere combinaties van volumes te vullen en frequenties in bloem-vormige 48-well MTPs schudden, zijn datasheets van de leverancier beschikbaar. Ook kunnen defecten van de groei van individuele culturen optreden als gevolg van lage bedragen van secundaire substraten (bijvoorbeeldstikstof, spoorelementen). Daarom controleren de biomassa concentraties aan het einde van teelten. In deze studie werden geen dergelijke groei-effecten waargenomen. Definieer het teelt-protocol voor het MBR-systeem (“BioLector”) als volgt: Filterset 1: Biomassa, krijgen 14. Filterset 2: pH, winst is vooraf ingesteld. Filterset 3: de pO2, winst is vooraf ingesteld. 4: GFP, krijgen 80. Schudden van frequentie: 1.200 rpm. Temperatuur: 30 ° C. Cyclustijd: 15 min. Experiment tijd: handleiding (teelt zal niet automatisch worden gestopt). Generatie van middellange stockoplossing pipetting lijstOpmerking: Bijna elke vloeistof handling robot systeem is in staat om te lezen pipetting acties uit externe bestanden. Kortom, de minimale informatie die nodig is het volume van de overdracht en de positie van reagens bron en de bestemming van elk vertegenwoordigd door een labware standpunt over het robotachtige dek en een specifieke holte binnen de labware. Echter, verschillende syntaxis voor verschillende vloeibaar handling-systemen moeten worden beschouwd. Figuur 2 toont een voorbeeld bestandsstructuur voor de werknemer pipetting system in deze studie. Vier soorten stamoplossingen worden afgepipetteerde in elke teelt goed: Voorraad van de oplossingen van media-onderdelen die zijn gevarieerd (“Variatie voorraden”). Water om te compenseren voor verschillende cumulatieve hoeveelheid boven voorraden. Een stockoplossing (“Rest voorraad”) met alle onderdelen die worden opgelost. Deze stamoplossing kan worden samengesteld uit de bouillon met de verschillende componenten die, bijvoorbeeld, die zijn opgeslagen op verschillende temperaturen of gesteriliseerd door verschillende methoden. Entmateriaal, die moet worden toegevoegd als de laatste component en zetten op de werktafel vlak voor de toevoeging om te voorkomen dat de afwikkeling van de cellen. Per teelt goed, de hoeveelheden die moeten worden overgedragen voor alle mediacomponenten volgens te berekenen: Het volume moet worden toegevoegd voor bepaalde Variatie voorraden misschien nul, dat wil zeggen, wanneer dit specifieke onderdeel wordt weggelaten. Herziening van alle berekende volumes Vik voor geschikt getallen. Pipetting volume stappen in volume stappen mag niet te klein. Pas indien nodig de concentraties van Variatie voorraden. Bijvoorbeeld, het minimale pipetting volume hier werd gedefinieerd als 10 µL, en de minimale toename werd gedefinieerd als 5 µL. In het algemeen moeten deze volumes op basis van de experimenteel bepaalde precisie en nauwkeurigheid van de gebruikte vloeistof verwerken station15,44worden gedefinieerd. Bereken het volume van de Rest voorraad met de vaste onderdelen voor alle putjes als volgt: waar de maximale cumulatieve hoeveelheid Variatie Stock wordt gebruikt. Bijgevolg als volgt de vereiste concentraties van de vaste onderdelen in Rest voorraad berekenen: Rest voorraad dienovereenkomstig voorbereiden. Per teelt goed, de hoeveelheid water moet worden toegevoegd als volgt te berekenen: Per teelt goed, een lijst van alle volumes te worden toegevoegd in de volgende volgorde van toevoeging: VH2O, VRestStock, Vik, VInok. Noteren de pipetting lijst volgens de specificaties van de vloeistof verwerken station, zoals te zien voor een voorbeeld in Figuur 2. Zaad cultuur, geautomatiseerde media voorbereiding en start van de belangrijkste cultuur Maak een protocol voor de liquid handling robot. Zie Figuur 3 en Figuur 4 voor een voorbeeld protocol voor een “Janus”-systeem, ten uitvoer gelegd in de bijbehorende software van de “WinPREP”. Het protocol moet de volgende aspecten overwegen: Omvatten een voldoende runtime van steriele woningen voorafgaand aan de voorbereiding van de media. Omvatten een eerste Overmatig schoonmaken en wassen van alle pipetting tips en buizen. Kies juiste labware containers voor stamoplossingen. Hier, zijn diep goed platen met 12 kolommen geschikt voor opslag van Variatie voorraden, zoals alle acht pipetting tips in een parallelle regeling in de goed kolommen onderdompelen kunnen. Dit versnelt sterk media voorbereiding. Als buizen van 15 mL of 50 mL reagens worden gebruikt als reservoirs, kunt slechts één pipetting tip onderdompelen in het tegelijk.Voor andere bestanden zoals water en Rest voorraad, worden 100 mL troggen gebruikt, aangezien deze stamoplossingen hogere volumes in totaal vereisen. Bieden een voldoende totaal volume voor elke stamoplossing te compenseren afval volumes, hoogte pipetting offsets, enz. Voeg een gebruiker prompt voor de inoculatie stap, ervoor te zorgen dat deze stap wordt uitgevoerd onmiddellijk voorafgaand aan de procedure van de cultuur zaad. Bereiden alle voorraadoplossingen in een steriele wijze en winkel tot gebruik, in geschikte containers, bijvoorbeeld, steriele 15 mL en 50 mL reageerbuizen. Steriliseren de diep goed platen voor stockoplossing opslag op een werktafel, bijvoorbeelddoor af te vegen met 70% ethanol en latere drogen in een laminaire flow-kap. Start de zaad-cultuur door het enten van 50 mL BHI medium met 25 mg/L kanamycine met een aliquoot gedeelte van de WCB. Voor de teelt van de MBR, verse, vitale entmateriaal van exponentieel groeiende culturen van het zaad in een voldoende hoeveelheid te bereiden. Leg alle nodige labware op de robotic werktafel en giet voorraadoplossingen in de overeenkomstige labware. Start de robotic workflow voor de voorbereiding van de media, zodat de laatste stap (inenting), in de tijd met de start van zaad cultuur is bereikt. De totale runtime van de robotic workflow moet eerder worden geëvalueerd. Hier, was de totale runtime ongeveer 1,5 uur. Proef de cultuur van het zaad na ongeveer 2 h, dan elk uur, om te controleren de groei door de optische dichtheid (OD600). Na ongeveer 5 uur, de cultuur bereikt van 3-4 OD600 en wordt gebruikt om te enten van de belangrijkste culturen. Plaats van de cultuur van het zaad op de vloeibare handler werktafel en het protocol van media voorbereiding blijven. Teelt MTP na inoculatie zegel. De verzegelde teelt MTP plaats in het BioLector-apparaat en start het vooraf gedefinieerde teelt-protocol. De resterende voorraadoplossingen, vervreemden reglementeringen bioveiligheid en indien nodig, en zaad van de cultuur van de robotic werktafel. Reinig de herbruikbare labware en start het vloeibare handler decontaminatie protocol. Product kwantificering en voorbewerken van raw-gegevens voor de analyse De belangrijkste cultuur na een runtime 17u stoppen. Het overbrengen van de meetgegevens van BioLector MBR telefoon naar de aangesloten computer met behulp van het softwarepakket BioLection volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant. Gebruik de “datamanagement → gegevens transformeren” functie van de “BioLection”-softwarepakket dat de MBR-systeem begeleidt om de ruwe data-bestand converteren naar een gemakkelijke toegang-werkbladindeling. De GFP signaal gegevens voor alle putjes van de teelt van de dichtst bij 17 h. Identificeer de GFP van de verwijzing teelt putten en de gemiddelde signalen timestamp-kolom kopiëren. Normaliseren alle resterende GFP signaal door de gemiddelde referentie-signaal. Kwantificeren van het GFP-titer met behulp van aanvullende methoden (indien nodig) De cel schorsingen van alle putjes van de teelt overboeken naar prelabeled reactie buizen en het supernatant cel-gratis verkrijgen na het centrifugeren gedurende 10 minuten op maximale snelheid met behulp van een benchtop centrifuge. 200 µL van elke cel-vrije supernatans overboeken naar een zwarte 96-Wells MTP met transparante onderstuk, en lees de GFP specifieke fluorescentie bij 488/520 nm met behulp van een passende microplate-lezer. Normaliseren van het GFP-signaal van alle putjes met gemiddelde signaal van referentie teelten, zoals in stap 1.5.3.Opmerking: De absolute GFP fluorescentie signalen kunnen niet worden vergeleken voor verschillende meetapparatuur. Daarom dienen de 5 variëteiten van de verwijzing van alle belangrijkste teelten als een interne standaard. De verbetering van de titer van het GFP kan worden uitgedrukt met betrekking tot de interne standaard. Dit zorgt voor de vergelijking van de resultaten van verschillende experimenten en verschillende GFP kwantificering methoden (Zie de volgende twee stappen). Het bepalen van het eiwitgehalte van de cel-vrije supernatant met standaardprotocollen, bijvoorbeeld, Bradford of BCA bepaling. In combinatie met de resultaten van stap 2 is de bepaling van een specifieke GFP-titer van eiwit mogelijk.Opmerking: Na fluorescentie-meting, gebruik het monster rechtstreeks vanuit deze microplate. Gebruik van meerkanaals pipetten vergemakkelijkt sterk de noodzakelijk vloeistof verwerken stappen. Uitvoeren van een SDS-Page visualisatie van cel-vrije supernatant standaard protocollen om te verifiëren dat het merendeel van het eiwitgehalte van de toename is te wijten aan toegenomen GFP secretie.Opmerking: De SDS-pagina is meer moeizaam dan de eerder genoemde methoden, met name met een hoge sample-belasting. Voor verificatiedoeleinden is het vaak voldoende om uit te voeren van de dat sds-pagina’s van de cel-vrije supernatant van referentie middellange en definitieve geoptimaliseerd middellange teelten15. 2. de sensitiviteitsanalyse (Figuur 1: onderdeel B). Opmerking: Het doel van dit deel is om te identificeren van de belangrijke factoren die een significant effect op de doelstelling hebben. Kies een bereik van de beginconcentratie van de media-onderdelen. De referentie middellange samenstelling moet liggen binnen de gekozen concentratie bereiken. Kies een passende DOE. Deze modellen kunnen worden gevonden in literatuur, bijvoorbeelduit het NIST/SEMATECH e-handboek van statistische methoden (beschikbaar op www.itl.nist.gov/div898/handbook/pri/section3/pri3347.htm). Het gekozen ontwerp afhankelijk van aantal mediacomponenten van belang (hier, 11) en het aantal uitgevoerde experimenten (hier, 32). In het gegeven voorbeeld, werd ontwerp “2IV11-6” gekozen die resulteert in 32 experimenten en staat van schatting van het effect van de verhoging van de concentratie van een van de elf onderdelen op de doelstelling van belang. Om specifieker te zijn, zijn de belangrijkste gevolgen niet verward met paarsgewijse factor interacties. Ze kunnen worden verward met hogere orde interacties die zijn echter waarschijnlijk niet significant. Gebruik de resterende putten (hier, 16) voor het uitvoeren van meerdere wordt gerepliceerd met de referentie-medium om de reproduceerbaarheid van het proces te bepalen. Replicatieonderzoeken moeten eveneens worden gespreid over de plaat om te ontdekken van positionele effecten. De gemiddelde waarde van de gemeten output van de verwijzing experimenten wordt gebruikt voor normalisatie. Dat wil zeggen, wordt elke gemeten output van de gevoeligheidsanalyse gedeeld door de gemiddelde waarde van de output van de verwijzing. Berekenen van de belangrijkste en indien mogelijk de combinatorische effecten met behulp van software van de relevante statistische gegevens. Het klassieke ontwerp van experiment is gebaseerd op een polynome onderlinge aanpassing45. Bijvoorbeeld, kan de MATLAB functie mvregress worden gebruikt voor de schatting van de polynoom coëfficiënten.De functie mvregress maakt deel uit van de statistieken en de machine leren toolbox. Het identificeren van de relevante gevolgen van verschillende media-onderdelen voor de doelstelling met behulp van een t-toets. In het voorbeeld NH4+ heeft een significant negatief effect en Ca2 + en Mg2 + Toon de sterkste positieve effecten (Figuur 5). Omdat GFP signaal was genormaliseerd, de coëfficiënten vertegenwoordigen de gemiddelde relatieve verandering in het GFP-signaal wanneer het toenemende concentratie van de specifieke component van de waarde ervan center, , de maximale waarde. Vaste onderdelen zonder een relevant effect zijn op hun referentiewaarde tijdens de optimalisatie. 3. iteratieve optimalisatie (Figuur 1: deel C) Opmerking: het hulpprogramma van de MATLAB KriKit werd gebruikt voor de interpretatie en de statistische gegevens analyse36. KriKit kan de gebruiker voor de bouw van een gegevensgestuurde Kriging model. Dit Kriging model voorspelt de functionele relatie tussen de media-onderdelen en de doelstelling. Het biedt ook informatie over de voorspelling onzekerheid. Grote onzekerheid geeft lawaaierige gegevens en/of onvoldoende gegevensdichtheid. DOEOpmerking: Nieuwe experimenten zijn iteratief ontwikkeld, gebaseerd op de resultaten van het vorige punt. In de eerste iteratie, ontwerpen nieuwe experimenten voor gedetailleerd onderzoek van geïdentificeerde mediacomponenten van belang. Experimentele resultaten van sectie 2 kunnen niet worden overgebracht naar de iteratieve optimalisatie (sectie 3), zoals de concentraties van componenten zonder relevante effect zijn nu bevestigd aan de respectieve referentiewaarde. Bijgevolg de experimenten van de gevoeligheidsanalyse en de iteratieve optimalisatie zijn niet vergelijkbaar. U kunt ook de regeling geïllustreerd in Figuur 1, frame “Iteratieve optimalisatie”. Als de optimale potentieel binnen het gedefinieerde concentratiebereik ligt, zijn nieuwe experimenten ontworpen met behulp van de verwachte verbetering40,46. Het experimentele ontwerp op basis van de verwachte verbetering is geïntegreerd in de werkset KriKit. Als het optimum op de grens ligt, vouwt u het concentratiebereik. Het uitvoeren van experimenten op de ontworpen meetpunten volgens experimentele methoden die zijn gedefinieerd in sectie 2. Statistische analyse Construeer een Kriging model met behulp van de gecombineerde gegevens van alle iteraties, met inbegrip van de stroom. Onderzoeken van de model-uitvoer door visualisatie met behulp van de uitgebreide instrumenten van KriKit (2/3D interpolatie, film analyse, screening van de plot, enz.). Als een optimale ruimte werd geschat met voldoende nauwkeurigheid, stoppen met optimalisatie. Als dat niet het geval is, gaat u verder met stap 3.1.Opmerking: Figuur 6 illustreert de iteratieve optimalisatie voor de studie van de test. Het concentratiebereik werd achtereenvolgens uitgebreid tot een plateau (iteratie 1-6) was gevonden. De zevende iteratie werd gebruikt voor het verkennen van de grenzen in meer detail. 4. verificatie van de resultaten (Figuur 1: deel D) Opmerking: Na het beëindigen van de iteratieve optimalisatie, de eerste veronderstellingen moeten worden gecontroleerd op geldigheid. Opnieuw gevoeligheidsanalyse (sectie 2) voor optimale middellange samenstelling. Dat wil zeggen, zijn de concentraties van onderdelen die zijn onderzocht in Figuur 1 (deel C) tot hun optimale waarden vastgelegd. Concentraties van andere componenten zijn gevarieerd volgens een passende DOE.Opmerking: Vergelijkbare resultaten in beide screenings aangeven dat de concentraties van de onderzochte onderdelen niets aan het effect van de andere componenten veranderen. Als de screening significante verschillen aan de resultaten van deel B toont, componenten met een gewijzigde effect moeten worden toegevoegd aan de pool van de onderzochte componenten en deel C moet worden herhaald. In het geval van indirecte meting (b.v., fluorescentie als indicator voor product concentratie), gelden orthogonale meting benaderingen (bv, activiteit assay, Bradford of BCA eiwit kwantificering, SDS pagina) om de wijziging te bevestigen de doelstelling van belang door het vergelijken van de resultaten van het referentie-medium en de geoptimaliseerde middellange15.

Representative Results

Het geïntroduceerde protocol werd toegepast voor het maximaliseren van de titer van secreted GFP. In het bijzonder de GFP titer na 17u voor teelt werd gekozen als de doelstelling van de optimalisatie. Online fluorescentie detectie van GFP toegestaan eenvoudig product kwantificering. De normalisatie van GFP signaal met gegevens uit de teelt van een verwijzing is echter onontbeerlijk om de reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van de resultaten. Een voorselectie van de mediacomponenten werd uitgevoerd op basis van rationele, zoals beschreven in sectie 1. Experimenten werden uitgevoerd volgens de instructies van deel 1: de parameters van de natte lab procedures waren gedefinieerd voor de hele studie samenhang en de reproduceerbaarheid van de resultaten. Zoals beschreven in sectie 2, werd een eerste screening voor het identificeren van relevante bestanddelen waaruit een significant effect op de optimalisatie doelstelling voor de verdere, meer gedetailleerde studie uitgevoerd. De MTP-gebaseerde MBR-systeem maakt het mogelijk 48 experimenten worden uitgevoerd in parallel. Rekening houdend met het maximaal mogelijke aantal parallelle experimenten op één MTP (48) en het totale aantal media onderdelen (11) maakt de 2IVontwerpen11-6 fractionele een goede keuze. Deze proefopzet bestaat uit 32 experimenten en maakt de schatting van het belangrijkste effect voor elk van de onderzochte media-onderdelen. De resterende teelt putten (16) werden gebruikt voor meerdere replicatieonderzoeken van experimenten met de referentie-medium reproduceerbaarheid en positionele effecten te beoordelen. Dat wil zeggen, elk experiment eenmaal is uitgevoerd (geen replicaten), met uitzondering van de verwijzing experiment (vijf wordt gerepliceerd). Tabel 1 geeft een overzicht van de resultaten van de analyse van de screening. In het weloverwogen concentratiebereik bleek variërend van de meerderheid van de mediacomponenten niet een merkbaar effect op het doel. Component NH4+ toont een sterk negatief effect, terwijl Ca2 + en Mg2 + Toon de sterkste positieve tendens. Het effect van Mg2 + is niet significant voor het stroombereik van concentratie, maar misschien wel voor een breder scala van de concentratie. Bijgevolg werd besloten te weglaten NH4+ van het medium en te onderzoeken van het effect van Ca2 + en Mg2 + in verdere experimenten. Sectie 3 beschrijft de iteratieve optimalisatie-procedure die wordt gebruikt voor het maximaliseren van het GFP fluorescentie signaal terwijl het variëren van de concentraties van Ca2 + en Mg2 +. In herhaling 1, werd de hypothese dat NH4+ kan worden weggelaten getest. Het concentratiebereik voor Ca2 + en Mg2 + goedgekeurd uit de analyse van de screening. De minimumconcentratie van NH4+ is ingesteld op nul en de maximale concentratie was overgenomen uit de screening-experiment. In de volgende experimenten, waren de component-concentraties verdeeld over een 3 x 3 x 3 grid binnen het gedefinieerde concentratiebereik, resulterend in 27 experimenten. Tijdens alle teelten, vijf replicatieonderzoeken van referentie medium werden opgenomen, die diende als interne standaard en om ervoor te zorgen dat geen positionele effecten over de MTP is opgetreden. Voor de resterende 16 putten, werden de concentraties van NH4+, Ca2 +en Mg2 + willekeurig verspreid binnen het opgegeven bereik. Figuur 5 A de resultaten van de eerste iteraties visualiseert. Aslabels verwijzen naar de concentraties van de component gebruikt in de oorspronkelijke verwijzing medium, aangegeven door x Ref. De blauwe oppervlakken vertegenwoordigen de Kriging interpolaties die werden berekend aan de hand van de KriKit software. Elk oppervlak is gekoppeld aan een relatieve concentratie voor NH4+ (donkerblauw: 0 x Ref, geruit: 1 x Ref, lichtblauw: 2 x Ref). Deze visuele representatie blijkt dat het is gunstig voor het weglaten van NH4+. Interpolatie oppervlakken tonen ook de positieve effecten van zowel Mg2 + en Ca2 +, als alle vliegtuigen stijgen met toenemende concentraties. Op basis van de resultaten van iteratie 1, werd besloten uit te breiden van de concentratie bereik van Ca2 + en Mg2 + door een verdubbeling van de maximale concentraties en verschuift de proefopzet venster naar de rechterbovenhoek, Zie Figuur 5 B. binnen dit bereik, de concentraties werden verspreid op een 6 x 6 raster. Dit zorgt voor een gelijkmatige verdeling over het volledige concentratiebereik, wat leidt tot optimale Kriging interpolatie resultaten. Figuur 5 B toont het Kriging interpolatie perceel op basis van de gecombineerde gegevens gemeten in beide iteraties (rode stippen en gele pleinen). Voor beide, Ca2 + en Mg2 +, blijft het positieve effect van de toenemende hun concentraties. Daarom de procedure werd herhaald door een verdubbeling van de maximale concentratie en dus de proefopzet venster werd verplaatst naar het verkennen van de grenzen van de hogere juiste hoek. Figuur 6 A geeft een overzicht van de resterende optimalisatie-procedure. Het onderzoek van de verzamelde data set tot iteratie 3 bleek dat een beperking van het positieve effect van Mg2 +, dat wil zeggen, een optimale concentratie bereik van Mg2 + werd geïdentificeerd. Daarom werd besloten verder uit te breiden het concentratiebereik alleen voor Ca2 + (iteratie 4). Deze procedure werd tweemaal herhaald (iteratie 5 en 6) totdat een verzadiging van het GFP-signaal is gevonden. Deze verzadiging is te verklaren door de neerslag van Ca-zouten voor de toegepaste concentraties van Ca2 +, die niet beschikbaar voor de cellen zijn. Als experimentele resultaten zijn altijd verstoord door het lawaai, de resulterende Kriging interpolatie verschijnt onregelmatig en visuele inspectie kan leiden tot valse conclusies. Echter kan het bereik van de optimale concentratie van media-onderdelen voor de verzadigde GFP-signaal op betrouwbare wijze worden geïdentificeerd met de statistische z -test, die ook ten uitvoer wordt gelegd in KriKit. De z -toets gebruikt direct de intrinsieke statistische informatie van de Kriging methode, d.w.z., voorspelling waarden en voorspelling onzekerheden. Figuur 6 B toont het geïdentificeerde plateau, als het vastberaden en gevisualiseerde met de werkset KriKit.Werkset KriKit is vrij beschikbaar36 en komt met een gedetailleerd leerprogramma dat verklaart hoe de functies te gebruiken. Als er meer dan twee relevante bestanddelen worden gevonden, bereikt 3D-visualisatie zijn limiet. KriKit biedt meerdere andere mogelijke visuele representatie methoden zoals films of “screening plot”. Als de optimale potentieel binnen het gedefinieerde concentratiebereik ligt, zijn nieuwe experimenten automatisch ontworpen met behulp van de verwachte verbetering40,46. Het experimentele ontwerp op basis van de verwachte verbetering is geïntegreerd in de werkset KriKit. Meer gedetailleerde informatie kan worden gevonden in de softwaredocumentatie. Nadat de iteratieve procedure, werd een verificatie van de resultaten uitgevoerd, zoals beschreven in deel D. De geldigheid van de oorspronkelijke aannames werd gecontroleerd door het uitvoeren van een gevoeligheidsanalyse van de extra met behulp van de optimale gemiddelde samenstelling. Dat wil zeggen, alle onderdelen van de oorspronkelijke media van belang waren gevarieerd, maar Ca2 + en Mg2 + waren ingesteld op hun optimale concentratieniveaus. In deze studie, de optimale concentraties = 32 x Ref en = 6.8 x Ref werden gekozen. Tabel 2 toont de resultaten van de validatie-screening. Net als bij de eerste gevoeligheid screening (Zie tabel 1), NH4+ heeft nog steeds een aanzienlijke negatieve invloed en resterende effecten zijn nog steeds te verwaarlozen. Als gevolg van de gemakkelijke toegang, werd het GFP fluorescentie signaal uit de teelt suspensie gebruikt voor het kwantificeren van de extracellulaire GFP-titer tijdens alle experimenten. Omwille van de controle, werd GFP fluorescentie gevalideerd tegen andere metingen. Omdat GFP wordt uitgescheiden via de Tat-traject, kan niet de fluorescentie-signaal discrimineren tussen intra- en extracellulaire GFP. Dus, teelten werden gereproduceerd met behulp van het referentie-medium en het geoptimaliseerde medium. Naast de fluorescentie-meting van cel-vrije teelt supernatant, gehalte aan andere melkeiwitten werd gekwantificeerd door de analyse van Bradford en (semi)-kwaliteitsverbetering GFP gevisualiseerd door SDS-pagina15. Alle resulterende meting signalen werden ongeveer verdubbeld voor teelten met geoptimaliseerde medium in vergelijking met referentie medium en gevalideerd de ongeveer 100% verbetering van de prestaties van de secretie van geoptimaliseerde medium. Bijgevolg kan GFP specifieke fluorescentie van schorsing van de teelt worden beschouwd als een geschikte metric voor optimalisatie doel, dat wil zeggen, de extracellulaire GFP-titer. Figuur 2 : Screenshot uit de lijst volume pipetting voor gevoeligheidsanalyse. Vermeldingen in de eerste kolom toewijzen een unieke id aan alle volumes van een rij; Deze identificatie is het MTP goed nummer van de doel-teelt MTP op de vloeibare handler werktafel, Zie Figuur 4C. Overige kolommen coderen volumes voor verschillende oplossingen (“Sln-01” tot “Sln-15”) om te worden afgepipetteerde. De cumulatieve omvang van één rij komt overeen met het volume van de definitieve teelt van de desbetreffende goed. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3 : Screenshot van de vloeistof behandeling controlesoftware “WinPREP”. Links: Rij-besteld opdrachten, met inbegrip van een opdracht voor bestandsoverdracht voor elke stamoplossing te worden afgepipetteerde. Voordat de definitieve opdracht voor toevoeging van het entmateriaal, wordt een gebruiker prompt ingevoegd om ervoor te zorgen dat de cultuur van het zaad wordt geplaatst aan de tafel net op tijd. Rechts: Schema van de werktafel, met inbegrip van de bron labware voor variatie voorraden (twee diep goed platen met 12 kolom-achtige wells), de trog reagens voor Rest voorraad, water en entmateriaal en de media voorbereiding doel teelt MTP. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4 : Compilatie van gedetailleerde screenshots voor installatie van pipetteren van een stamoplossing. (A) pakte opdracht voor pipetteren van Fe voorraad. Bron labware en bron goed worden binnen gemarkeerd op de werktafel door het Lees frame en de rode kolom van de overeenkomstige diep goed plaat. Bestemming labware en bestemming wells binnen zijn gekenmerkt door het blauwe kader rond en blauwe putjes van de target teelt MTP. (B) gedetailleerd voorbeeld zicht op toewijzing van pipetting volumes voor deze stap (Fe stockoplossing). Aantal bestemmingen wordt afgelezen uit de pipetting lijst, die bestaat uit 48 rijen. Het Doseer volumes voor alle putjes van de bestemming voor Fe stockoplossing wordt gevonden in kolom 4 in de pipetting lijst. Merk op dat de eerste kolom in de pipetting lijst bevat id’s en niet de volumes kunnen worden overgedragen, Zie Figuur 2. (C) gegevens over de bestemming goed nummering. Volumes die zijn geschreven in de rij #1 van de bijbehorende pipetting lijst zal worden pipetted in goed gemarkeerd als #1, enzovoort. Wells #01, 08 #, #41 en #48 overeen met putjes A01, A08, F01 en F08 voor de alpha-numerieke codering, die ook in de teelt MTP zelf is afgedrukt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 5 : Gedetailleerde resultaten vanaf de eerste iteratie. (A) Kriging interpolatie gebaseerd op experimentele gegevens van iteratie 1. Rode stippen geven de gegevensset. Ter vergelijking, alle drie interpolatie oppervlakken zijn overlay in één perceel (donkerblauw: 0 x Ref, geruit: 1 x Ref, lichtblauw: 2 x Ref). Een alternatieve weergave van de resultaten kan worden gevonden elders15. (B) Kriging interpolatie op basis van de experimenten uitgevoerd in herhaling 1 (rode stippen) en iteratie 2 (gele pleinen).Delen van de gegevens in dit cijfer zijn eerder gepubliceerde15. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 6 : Afbeelding van iteratief verzamelde optimalisatie resultaten. (A) definitieve Kriging model voorspelling. (B) statistische identificatie van optimale ruimte (rood) op basis van de statistische z-test, die wordt verstrekt door KriKit. Vakken geven aan opeenvolgende stappen van iteratieve ontwerp en uitvoering van experimenten. Delen van de gegevens in dit cijfer zijn eerder gepubliceerde15. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Component Gemiddelde waarde van de genormaliseerde coëfficiënt Fe2 + -0.08 MN2 + -0.05 Zn2 + -0.21 Cu2 + -0.21 NH4+ -2.04 Ni2 + -0.11 Co2 + -0.10 MoO42- 0.03 BO33- 0,06 CA2 + 1,00 Mg2 + 0,45 Tabel 1: resultaten van de gevoeligheidsanalyse. Coëfficiënt waarden dat het gemiddelde effect aangeeft wanneer verhoogt de concentratie van de respectieve media-component van de waarde van het centrum op de maximale waarde. Voor optimale experimentele designs, zoals gevonden in de standaard literatuur en gebruikt hier de standaarddeviatie geeft direct de experimentele variatie toe te schrijven aan de replicatie van het referentie-experiment. Coëfficiënt waarden zijn genormaliseerd door de maximale waarde (0.0422 voor component Ca2 +). De standaarddeviatie van de genormaliseerde en absolute coëfficiënt is 0.54 en 0.0226, respectievelijk. Component Gemiddelde waarde van de genormaliseerde coëfficiënt Fe2 + -1.00 MN2 + 1,00 Zn2 + -3.48 Cu2 + -0.52 NH4+ -15.95 Ni2 + 0.69 Co2 + -0.51 MoO42- -0.45 BO33- -1.11 Tabel 2: resultaten van de definitieve gevoeligheidsanalyse. Coëfficiënt waarden dat het gemiddelde effect aangeeft wanneer verhoogt de concentratie van de respectieve media-component van de waarde van het centrum op de maximale waarde. Zoals een optimale proefopzet werd gebruikt, hangt de standaarddeviatie alleen de experimentele variatie met behulp van de geoptimaliseerde middellange samenstelling. Experimentele variatie licht gestegen in vergelijking met de variatie met behulp van het referentie-medium. Coëfficiënt waarden zijn genormaliseerd door de maximale waarde (0.0106 voor component Mn2 +). De standaarddeviatie van de genormaliseerde en absolute coëfficiënt is 3,63 en 0.0385, respectievelijk.

Discussion

De algemene aard van het gepresenteerde protocol kunt verschillende aanpassingen, bijvoorbeeldvoor het bestuderen van andere microbiële expressie hosts⁹^,⁴⁷^,⁴⁸^,⁴⁹^,⁵⁰^, ⁵¹, of andere eigenschappen van de doel-eiwitten, zoals glycosylatie patroon of dissulfide bindingen te optimaliseren. Het protocol wellicht ook worden aangepast aan de beschikbare lab-apparatuur. De integratie van een MBR-systeem kunt verhogen van experimentele doorvoer, waarmee grote besparingen in tijd. Bij vervanging volledig geïnstrumenteerde en controleerbare bioreactoren door MBR systemen dient schaalbaarheid van resultaten evenwel worden overwogen⁸^,³⁷^,⁵²^,⁵³. Het gebruik van DOE methodologieën en wiskundige modellering helpt bij het maximaliseren van de informatie-inhoud van meetgegevens met betrekking tot de bestudeerde objectieve⁵⁴ door efficiënte experimentele planning en model-gebaseerde data interpretatie¹⁵.

Wijzigingen in de methode
Naast multifunctioneel en uitbreidbaar robotic liquid handling-systemen zoals gebruikt in deze studie, dient te worden vermeld zijn er verschillende kleinere liquid handling-systemen commercieel beschikbaar die geschikt zijn voor het uitvoeren van deze taak en afvaltonnen van laminaire flow werk bankjes. Als geen enkel geautomatiseerde pipetting systeem beschikbaar is, kunnen het zijn dat verschillende media composities volgens het plan DOE ook worden gerealiseerd door handmatige pipetteren met behulp van interne en/of meerkanaals pipetten. Aangezien de handmatige voorbereiding meer gevoelig voor fouten is en zeer gerichte werk voor heel lange tijd vergt, is het aanbevolen om een lager aantal composities van verschillende media voor te bereiden.

Afhankelijk van de mogelijkheden van de werknemer MBR-systeem, zal het bijbehorende protocol van de teelt variëren. Bijvoorbeeld, als er geen online meting van biomassa formatie beschikbaar is, wellicht volstaat het voor het meten van de concentratie van de biomassa na voltooiing van de groei-experiment. In combinatie met online monitoring van de pH en de opgeloste zuurstof, die wordt uitgevoerd in verschillende systemen van de MBR, de groei verzadiging kan veilig worden bepaald. In principe kunnen de groei experimenten worden uitgevoerd in MTPs alleen in schudden van starterscentra, zonder het gebruik van een MBR-systeem geplaatst. In dit geval goede teelt voorwaarden moeten worden gewaarborgd: (1) zuurstof-limited teelten kunnen worden vermeden door het gebruik van MTPs met geschikte geometrieën, in combinatie met de juiste frequenties schudden en schudden diameters, bijvoorbeeld, vierkant 96 of 24 diep goed platen bediend, 1000 rpm op 3 mm afstand of bij 250 omwentelingen per minuut op afstand 25 mm, respectievelijk. Nog belangrijker is, hoe lager de overdrachtssnelheden haalbaar maximale zuurstof, hoe lager de belangrijkste koolstofbron moet worden geconcentreerd. Zoals hierboven vermeld, voor deze studie, was het gebruik van 10 g/L glucose geschikt om te voorkomen dat zuurstof beperking voor de werknemer teelt voorwaarden; (2) bemonstering van de culturen van de MTP voor biomassa en product kwantificering moet tot een minimum worden beperkt. Telkens wanneer die de MTP is verwijderd uit de schudden incubator, zuurstof overdracht zal onmiddellijk uitsplitsing die leiden ongunstige teelt voorwaarden tot kan; (3) in het advies van de auteurs, wordt het gebruik van MTP lezers als teelt apparaten niet aanbevolen omdat deze apparaten zijn niet ontwikkeld voor dit doel. Bijvoorbeeld, schudden mechanica werden gebouwd voor de occasionele mengen van microplates na de toevoeging van het reagens en dus vaak gebrek aan robuustheid voor lange runs van voortdurend schudden blijvende dagenlang. Bovendien, kan niet voldoende ingangsvermogen nodig voor microbiële teelten in deze lezers worden gerealiseerd. De integratie van de gemeten optische dichtheid in korte tijdsintervallen vereist stoppen van het schudden beweging, wat resulteert in herhaalde perioden van zuurstof beperking. Bovendien zal verdamping in dergelijke systemen over perioden van de lange teelt resultaten verstoren. Voor meer details over het verrassend complexe onderwerp over het gebruik van MTPs voor microbiële teelten, wordt de lezer verwezen naar de geciteerde literatuur²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶en verwijzingen daarin.

Verdere overwegingen
Speed-up iteratieve optimalisatie stappen, is het aangeraden om zorgvuldig selecteren de analytische methode voor de kwantificering van het product. Snelle en eenvoudige methoden de voorkeur verdient ten koste van de precisie en nauwkeurigheid, zoals de strategie van iteratieve proefopzet experimentele onnauwkeurigheid tolereert. De definitieve resultaten moeten echter worden gecontroleerd tegen voldoende precieze en accurate product kwantificering methodes die ingewikkelder wellicht. In het algemeen, zorgvuldige evaluatie en de besluitvorming over de studie procedures vereist inspanning in het begin van de studie, maar betalen op de lange termijn, nadat routinemethoden hebben vastgesteld.

Het is sterk aanbevolen om het definiëren van een referentie-experiment, dat ten opzichte van is alle experimenten tijdens de optimalisatie. Dat wil zeggen, worden de toegepaste middellange component concentraties evenals gemeten output via delen door referentiewaarden genormaliseerd. Op deze manier worden alle toegepast en gemeten waarde kan worden geïnterpreteerd als de x-vouw van de referentiewaarde. Om te houden rekening variaties tussen de platen, worden vijf referentie experimenten uitgevoerd op elke plaat. De gemiddelde waarde van de gemeten resultaten wordt gebruikt voor de normalisatie.

Het kan over het algemeen niet worden gegarandeerd dat het ontwikkelde medium ook optimaal voor andere stammen is. Het verbeterde medium zal waarschijnlijk ook wel geschikt voor het cultiveren van expressie stammen met kleine genetische verschillen, bijvoorbeeldwanneer mutagenese studies (produceren enzym varianten met één aminozuur vervangingen verkregen Hoewel zelfs één puntmutaties zijn beschreven effect cellulaire metabolisme en heterologe expressie prestaties⁵⁵^,⁵⁶). In dit geval kan een eerste stap, gevolgd door protocollen voor high-throughput expressie screenings⁵⁷dienen als de gepresenteerde protocol. Als het protocol wordt gebruikt voor middellange ontwikkeling met latere schaal-up van fed-batch teelten, het geoptimaliseerde medium dient te worden geverifieerd voor de bijbehorende Bioprocestechnologie-voorwaarden, zoals kloon screening van campagnes op de microscale verschillende top artiesten voor verschillende voeding strategieën en teelt media⁵²^,⁵⁸. Bovendien kan de geïntroduceerde KriKit³⁶ in het algemeen bijdragen tot verbeterde holistische Bioprocestechnologie optimalisatie.Pas onlangs, waren de tool capaciteiten uitgebreid ook steunen multi objectieve optimalisatie⁴⁰, kunnen die van belang zijn voor het optimaliseren van beide bedrijven stroomopwaarts en stroomafwaarts processen⁵⁹^,⁶⁰.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De wetenschappelijke activiteiten van het centrum van de wetenschap van de bosbouwbiomassa waren het financieel ondersteund door het ministerie van innovatie, wetenschap en onderzoek in het kader van de NRW-Strategieprojekt-BioSC (nr. 313/323-400-002 13). De auteurs bedanken de ministerie van innovatie, wetenschap, en onderzoek van Noordrijn-Westfalen en de Heinrich Heine Universiteit Düsseldorf voor een beurs voor Lars Freier binnen de CLIB-afgestudeerde Cluster industriële biotechnologie. Verdere financiering van het programma spaties inschakelen “Helmholtz innovatie Labs” van Duitse Helmholtz vereniging ter ondersteuning van het “microbiële Bioprocess Lab – A Helmholtz Innovation Lab” ontvangen.

Materials

BioLector	m2p-labs	G-BL-100
Flowerplate	m2p-labs	MTP-48-BOH	For cultivation in the BioLector device
Sealing foil	m2p-labs	F-GP-10	Sterile sealing for Flowerplate
MATLAB	Mathworks	2016b
KriKit	Forschungszentrum Jülich	n/a	Freely available, MATLAB installation required
Janus pipetting robot	Perkin Elmer	n/a	Includes "WinPrep" software installation
12-column deep well microplate	E&K Scientific	EK-2034	Container for medium stock solutions
96 well microplates, transparent, F-bottom	Greiner	655101	For Bradford protein assay
µclear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom	Greiner	655087	For flourescence measurement in cell-free supernatants
Pipette Research plus multi-channel pipettes	Eppendorf	n/a	Facilitates manual liquid handling with microplates
TruPAG Precast Gels	Sigma	PCG2002	For SDS-Page analysis of cell-free supernantants
Bradford Reagent	Sigma	B6916
C. glutamicum pCGPhoD^Bs-GFP	n/a	n/a	Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007)

References

Choi, J. -. M., Han, S. -. S., Kim, H. -. S. Industrial applications of enzyme biocatalysis: Current status and future aspects. Biotechnol Adv. 33 (7), 1443-1454 (2015).
Li, S., Yang, X., Yang, S., Zhu, M., Wang, X. Technology Prospecting on Enzymes: Application, Marketing and Engineering. Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), (2012).
Adrio, J. L., Demain, A. L. Microbial enzymes: tools for biotechnological processes. Biomolecules. 4 (1), 117-139 (2014).
Yim, S. S., An, S. J., Kang, M., Lee, J., Jeong, K. J. Isolation of fully synthetic promoters for high-level gene expression in Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Bioeng. 110 (11), 2959-2969 (2013).
Hemmerich, J., et al. Use of a Sec signal peptide library from Bacillus subtilis.for the optimization of cutinase secretion in Corynebacterium glutamicum. Microb Cell Fact. 15 (1), 208 (2016).
Wendisch, V. F. Microbial production of amino acids and derived chemicals: synthetic biology approaches to strain development. Curr Opin Biotechnol. 30, 51-58 (2014).
Lee, J. -. Y., Na, Y. -. A., Kim, E., Lee, H. -. S., Kim, P. The Actinobacterium Corynebacterium glutamicum, an Industrial Workhorse. J Microbiol Biotechnol. 26 (5), 807-822 (2016).
Rohe, P., Venkanna, D., Kleine, B., Freudl, R., Oldiges, M. An automated workflow for enhancing microbial bioprocess optimization on a novel microbioreactor platform. Microb Cell Fact. 11 (1), 144 (2012).
Liu, X., et al. Expression of recombinant protein using Corynebacterium glutamicum.: progress, challenges and applications. Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 652-664 (2016).
Freudl, R., Burkovski, A. Corynebacterium glutamicum as a Platform Organism for the Secretory Production of Heterologous Proteins. Corynebacterium glutamicum: From systems biology to biotechnological applications. , 161-177 (2015).
Yim, S. S., et al. Development of a new platform for secretory production of recombinant proteins in Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Bioeng. 113 (1), 163-172 (2015).
Limberg, M. H., et al. Metabolic profile of 1,5-diaminopentane producing Corynebacterium glutamicum under scale-down conditions: Blueprint for robustness to bioreactor inhomogeneities. Biotechnol Bioeng. 114 (3), 560-575 (2016).
Käβ, F. Assessment of robustness against dissolved oxygen/substrate oscillations for C. glutamicum DM1933 in two-compartment bioreactor. Bioprocess Biosyst Eng. 37 (6), 1151-1162 (2014).
Teramoto, H., Watanabe, K., Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. High yield secretion of heterologous proteins in Corynebacterium glutamicum.using its own Tat-type signal sequence. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 677-687 (2011).
Freier, L., Hemmerich, J., Schöler, K., Wiechert, W., Oldiges, M., von Lieres, E. Framework for Kriging-based iterative experimental analysis and design: Optimization of secretory protein production in Corynebacterium glutamicum. Eng Life Sci. 16 (6), 538-549 (2016).
Huber, R., Roth, S., Rahmen, N., Büchs, J. Utilizing high-throughput experimentation to enhance specific productivity of an E. coli. T7 expression system by phosphate limitation. BMC Biotechnol. 11 (1), 22 (2011).
Kottmeier, K., Müller, C., Huber, R., Büchs, J. Increased product formation induced by a directed secondary substrate limitation in a batch Hansenula polymorpha culture. Appl Microbiol Biotechnol. 86 (1), 93-101 (2010).
Kennedy, M. J., Krouse, D. Strategies for improving fermentation medium performance: A review. J Ind Microbiol Biotechnol. 23 (6), 456-475 (1999).
Kleman, G. L., Strohl, W. R. Developments in high cell density and high productivity microbial fermentation. Curr Opin Biotechnol. 5 (2), 180-186 (1994).
Jones, R., Gadd, G. Ionic nutrition of yeast: Physiological mechanisms involved and implications for biotechnology. Enzy Microb Technol. 12 (6), 402-418 (1990).
Zhang, J., Greasham, R. Chemically defined media for commercial fermentations. Appl Microbiol Biotechnol. 51 (4), 407-421 (1999).
Kensy, F., et al. Oxygen transfer phenomena in 48-well microtiter plates: Determination by optical monitoring of sulfite oxidation and verification by real-time measurement during microbial growth. Biotechnol Bioeng. 89 (6), 698-708 (2005).
Hermann, R., Lehmann, M., Büchs, J. Characterization of gas-liquid mass transfer phenomena in microtiter plates. Biotechnol Bioeng. 81 (2), 178-186 (2002).
Duetz, W. A. Microtiter plates as mini-bioreactors: Miniaturization of fermentation methods. Trends Microbiol. 15 (10), 469-475 (2007).
Funke, M., Diederichs, S., Kensy, F., Müller, C., Büchs, J. The baffled microtiter plate: Increased oxygen transfer and improved online monitoring in small scale fermentations. Biotechnol Bioeng. 103 (6), 1118-1128 (2009).
Lattermann, C., Funke, M., Hansen, S., Diederichs, S., Büchs, J. Cross-section perimeter is a suitable parameter to describe the effects of different baffle geometries in shaken microtiter plates. J Biol Eng. 8, 18 (2014).
Samorski, M., Müller-Newen, G., Büchs, J. Quasi-continuous combined scattered light and fluorescence measurements: A novel measurement technique for shaken microtiter plates. Biotechnol Bioeng. 92 (1), 61-68 (2005).
Kensy, F., Zang, E., Faulhammer, C., Tan, R. -. K., Büchs, J. Validation of a high-throughput fermentation system based on online monitoring of biomass and fluorescence in continuously shaken microtiter plates. Microb Cell Fact. 8 (1), 31 (2009).
Puskeiler, R., Kaufmann, K., Weuster-Botz, D. Development, parallelization, and automation of a gas-inducing milliliter-scale bioreactor for high-throughput bioprocess design (HTBD). Biotechnol Bioeng. 89 (5), 512-523 (2005).
Bareither, R., Pollard, D. A review of advanced small-scale parallel bioreactor technology for accelerated process development: Current state and future need. Biotechnol Prog. 27 (1), 2-14 (2011).
Hortsch, R., Stratmann, A., Weuster-Botz, D. New milliliter-scale stirred tank bioreactors for the cultivation of mycelium forming microorganisms. Biotechnol Bioeng. 106 (3), 443-451 (2010).
Isett, K., George, H., Herber, W., Amanullah, A. Twenty-four-well plate miniature bioreactor high-throughput system: Assessment for microbial cultivations. Biotechnol Bioeng. 98 (5), 1017-1028 (2007).
Motta Dos Santos, L. F., Coutte, F., Ravallec, R., Dhulster, P., Tournier-Couturier, L., Jacques, P. An improvement of surfactin production by B. subtilis BBG131 using design of experiments in microbioreactors and continuous process in bubbleless membrane bioreactor. Bioresour Technol. 218, 944-952 (2016).
Islam, R. S., Tisi, D., Levy, M. S., Lye, G. J. Framework for the Rapid Optimization of Soluble Protein Expression in Escherichia coli Combining Microscale Experiments and Statistical Experimental Design. Biotechnol Prog. 23 (4), 785-793 (2007).
Huber, R., et al. Robo-Lector: A novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microb Cell Fact. 8 (1), 42 (2009).
. Kriging toolKit (KriKit) Available from: https://github.com/modsim/KriKit (2017)
Kensy, F., Engelbrecht, C., Büchs, J. Scale-up from microtiter plate to laboratory fermenter: evaluation by online monitoring techniques of growth and protein expression in Escherichia coli.and Hansenula polymorpha fermentations. Microb Cell Fact. 8 (1), 68 (2009).
Lu, C., Bentley, W. E., Rao, G. A high-throughput approach to promoter study using green fluorescent protein. Biotechnol Prog. 20 (6), 1634-1640 (2004).
Zanzotto, A., Boccazzi, P., Gorret, N., van Dyk, T. K., Sinskey, A. J., Jensen, K. F. In situ measurement of bioluminescence and fluorescence in an integrated microbioreactor. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 40-47 (2006).
Freier, L., von Lieres, E. Multi-Objective Global Optimization (MOGO): Algorithm and Case Study in Gradient Elution Chromatography. Biotechnol J. , (2016).
Keilhauer, C., Eggeling, L., Sahm, H. Isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum.: molecular analysis of the ilvB-ilvN-ilvC operon. J Bacteriol. 175 (17), 5595-5603 (1993).
Weuster-Botz, D., Kelle, R., Frantzen, M., Wandrey, C. Substrate Controlled Fed-Batch Production of L-Lysine with Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Prog. 13 (4), 387-393 (1997).
Meissner, D., Vollstedt, A., van Dijl, J. M., Freudl, R. Comparative analysis of twin-arginine (Tat)-dependent protein secretion of a heterologous model protein (GFP) in three different Gram-positive bacteria. Appl Microbiol Biotechnol. 76 (3), 633-642 (2007).
Morschett, H., Wiechert, W., Oldiges, M. Automation of a Nile red staining assay enables high throughput quantification of microalgal lipid production. Microb Cell Fact. 15, 34 (2016).
Fisher, R. A. . The design of experiments. , (1935).
Morschett, H., Freier, L., Rohde, J., Wiechert, W., von Lieres, E., Oldiges, M. A framework for accelerated phototrophic bioprocess development: Integration of parallelized microscale cultivation, laboratory automation and Kriging-assisted experimental design. Biotechnol Biofuels. 10, 26 (2017).
Le Loir, Y., et al. Protein secretion in Lactococcus lactis: An efficient way to increase the overall heterologous protein production. Microb Cell Fact. 4 (1), 2 (2005).
Anné, J., Vrancken, K., van Mellaert, L., van Impe, J., Bernaerts, K. Protein secretion biotechnology in Gram-positive bacteria with special emphasis on Streptomyces lividans. Biochim Biophys Acta. 1843 (8), 1750-1761 (2014).
Gupta, S. K., Shukla, P. Advanced technologies for improved expression of recombinant proteins in bacteria: perspectives and applications. Crit Rev Biotechnol. 36 (6), 1089-1098 (2016).
Fu, L. L., Xu, Z. R., Li, W. F., Shuai, J. B., Lu, P., Hu, C. X. Protein secretion pathways in Bacillus subtilis: implication for optimization of heterologous protein secretion. Biotechnol Adv. 25 (1), 1-12 (2007).
Yoon, S., Kim, S., Kim, J. Secretory Production of Recombinant Proteins in Escherichia coli. Rec Pat Biotechnol. 4 (1), 23-29 (2010).
Hemmerich, J., et al. Comprehensive clone screening and evaluation of fed-batch strategies in a microbioreactor and lab scale stirred tank bioreactor system: application on Pichia pastoris producing Rhizopus oryzae lipase. Microb Cell Fact. 13 (1), 36 (2014).
Glazyrina, J., Krause, M., Junne, S., Glauche, F., Strom, D., Neubauer, P. Glucose-limited high cell density cultivations from small to pilot plant scale using an enzyme-controlled glucose delivery system. New Biotechnol. 29 (2), 235-242 (2012).
Gernaey, K. V., et al. Monitoring and control of microbioreactors: An expert opinion on development needs. Biotechnol J. 7 (10), 1308-1314 (2012).
Rahmen, N., Fulton, A., Ihling, N., Magni, M., Jaeger, K. -. E., Büchs, J. Exchange of single amino acids at different positions of a recombinant protein affects metabolic burden in Escherichia coli. Microb Cell Fact. 14, 10 (2015).
Rahmen, N., et al. A particular silent codon exchange in a recombinant gene greatly influences host cell metabolic activity. Microb Cell Fact. 14, 156 (2015).
Saez, N. J., Nozach, H., Blemont, M., Vincentelli, R. High throughput quantitative expression screening and purification applied to recombinant disulfide-rich venom proteins produced in E. coli. J Vis Exp. (89), e51464 (2014).
Scheidle, M., et al. High-throughput screening of Hansenula polymorpha clones in the batch compared with the controlled-release fed-batch mode on a small scale. FEMS Yeast Res. 10 (1), 83-92 (2010).
Baumann, P., Bluthardt, N., Renner, S., Burghardt, H., Osberghaus, A., Hubbuch, J. Integrated development of up- and downstream processes supported by the Cherry-Tag™ for real-time tracking of stability and solubility of proteins. J Biotechnol. 200, 27-37 (2015).
Baumann, P., Hahn, T., Hubbuch, J. High-throughput micro-scale cultivations and chromatography modeling: Powerful tools for integrated process development. Biotechnol Bioeng. 112 (10), 2123-2133 (2015).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Hemmerich, J., Freier, L., Wiechert, W., von Lieres, E., Oldiges, M. Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology. J. Vis. Exp. (130), e56234, doi:10.3791/56234 (2017).