Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme
Summary
Lazer ile uzun dalga boyu çok foton Floresans uyarma mikroskobu tarama gelişmiş optik teknikleri bir arada Tg (sox10:EGFP) ve Tg (foxd3:GFP) Zebra balığı embriyo nöral crest göçün yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu, gerçek zamanlı görüntüleme yakalamak için uygulanmıştır.
Abstract
Konjenital göz ve kraniyofasiyal anomaliler nöral crest, vücut boyunca çok sayıda hücre tipleri ortaya çıkmasına göçmen kök hücreler geçici bir nüfusa aksamalar yansıtır. Biyoloji nöral Crest anlama okudu vivo içinde olabilir genetik olarak uysal modelleri ve gerçek zamanlı olarak yansıtan sınırlı olmuştur. Zebra balığı nöral crest gibi göçmen hücre popülasyonlarının çalışmak için özellikle önemli bir gelişim modelidir. Erken nöral crest farklılaşma düzenlenmesi ve işaretçileri nöral crest hücreler için büyük olasılıkla gösterir çok sayıda hayvan modellerinde gösterilmiştir sox10 ve foxd3 gibi nöral crest geçiş gelişmekte olan göz içine incelemek için lazer ile uzun dalga boyu çok foton Floresans uyarma mikroskobu tarama gelişmiş optik teknikleri bir arada gelişmekte olan gözlerinin içine transgenik Zebra balığı embriyolar, yani Tg (sox10:EGFP) ve Tg (foxd3:GFP), yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu, gerçek zamanlı video yakalama için uygulanmıştır. Çoklu foton hızlandırılmış görüntüleme davranış ve erken göz gelişmesine katkıda bulunan iki nöral crest hücre popülasyonlarının göç desenleri ayırt için kullanıldı. Bu iletişim kuralı hızlandırılmış videoları, Zebra balığı nöral crest göç sırasında örnek olarak oluşturma hakkında bilgi sağlar ve daha fazla erken gelişme Zebra balığı ve diğer canlılar birçok yapıların görselleştirmek için uygulanabilir.
Introduction
Konjenital göz hastalıkları çocukluk körlüğe neden olabilir ve kafatası nöral crest anormallikleri nedeniyle çoğu kez. Nöral crest hücreler Nöral tüp sizden ortaya çıkan ve vücut boyunca çok sayıda doku formu geçici kök hücreleri vardır. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 nöral crest hücreleri, ön ve mesencephalon,’kemik ve kıkırdak midface ve frontal bölgelerde ve Iris, kornea, Trabeküler meshwork ve gözün ön segmentte sklera neden olmaktadır. 4 , 6 , 7 , 8 nöral crest hücrelerden faringeal arches rhombencephalon formu, çene ve kardiyak çıkış yolu. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 çalışmalar nöral Crest için oküler katkıları ve Perioküler geliştirme, bu hücreler omurgalı gözü geliştirme önemini vurgulayan sermiştir. Nitekim, nöral crest hücre göç ve farklılaşma bozulma yol Fasiyal ve oküler anomaliler için Axenfeld-Rieger sendromu ve engin artı sendromu gibi. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 böylece, geçiş, yayılması ve bu nöral crest hücrelerinin farklılaşması kapsamlı bir anlayış Konjenital göz hastalıklarının altında yatan karmaşıklığı görmemizi sağlar.
Zebra balığı türleri çalışmak için oküler gelişim, Zebra balığı göz memeli meslektaşlarına benzer yapılardır ve birçok genler örümceklerle Zebra balığı ve memeliler arasında korunmuş bir güçlü model organizmadır. 18 , 19 , 20 Ayrıca, Zebra balığı embriyo şeffaf ve yumurtlayan, göz geliştirme gerçek zamanlı görselleştirme kolaylaştırmak vardır.
Daha önce yayımlanmış iş genişletilmesi,6,7,20 nöral crest hücre göç desen çok foton floresan yeşil flüoresan protein (GFP) SRY (cinsiyet belirleme bölgesi Y) transkripsiyon kontrolü altında etiketlenmiş transgenik Zebra balığı satırlarındaki Imaging hızlandırılmış kullanarak tanımlanmıştır-kutusu 10 (sox10) veya Forkhead kutusunu D3 (foxd3) gen düzenleyici bölgeler. 21 , 22 , 23 , 24. çoklu foton Floresans hızlandırılmış görüntüleme lazer mikroskobu ile fluorophores edilen örneklerin yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu görüntüleri yakalamak için uzun dalga boyu çok foton Floresans uyarma ile tarama gelişmiş optik teknikleri birleştiren güçlü bir teknik olduğunu. 25 , 26 , 27 çok foton lazer kullanımı artan doku penetrasyonu ve azalan fluorophore ağartma dahil olmak üzere standart confocal mikroskobu üzerinde belirgin avantajları vardır.
Bu yöntemi kullanarak, nöral crest hücre göç ve göçmen yolları zamanlama konusunda farklı iki ayrı nüfus oluşturulmaması, yani foxd3 pozitif nöral crest hücrelerde Perioküler Mezenşim ve gelişmekte olan göz ve sox10 pozitif nöral crest kraniyofasiyal Mezenşim hücreleri vardı. Bu yöntemle, Zebra balığı oküler ve Fasiyal nöral crest göç göç görselleştirmek için bir yaklaşım tanıttı geliştirme sırasında gerçek zamanlı olarak düzenlenmiş nöral crest geçiş gözlemlemek kolaylaştırır.
Bu iletişim kuralı Tg (sox10:EGFP) ve bir örnek olarak Tg (foxd3:GFP) transgenik Zebra balığı erken göz gelişimi sırasında hızlandırılmış videoları oluşturma hakkında bilgi sağlar. Bu iletişim kuralı daha da erken gelişme Zebra balığı nöral crest hücrelerden türetilmiş herhangi bir oküler ve Fasiyal yapısının yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu, gerçek zamanlı görselleştirme için uygulanabilir. Ayrıca, bu yöntem diğer doku ve organların Zebra balığı ve diğer hayvan modelleri geliştirilmesi görüntüleme için daha da uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çoklu foton hızlandırılmış görüntüleme geçici ve göçmen hücre popülasyonlarının vivo izlenmesini sağlar. Bu güçlü teknik embriyonik süreçleri gerçek zamanlı eğitim için kullanılabilir ve bu da çalışmanın, bu yöntemi sonuçları nöral crest hücre göç ve kalkınma geçerli bilgisine gelişmiş. Önceki zaman hata görüntüleme çalışmaları genellikle mikroskobu tarama confocal lazer kullanmaktadır. 29 , 30 ,</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Thomas Schilling nazikçe Tg (sox10:eGFP) Balık ve Mary Halloran nazikçe Tg(foxd3:GFP) balık hediye hediye için teşekkür ederiz.
Materials
| Breeding Tanks with Dividers | Aquaneering | ZHCT100 | Crossing Tank Set (1.0-liter) Clear Polycarbonate with Lid and Insert |
| M205 FA Combi-Scope | Leica Microsystems CMS GmbH | Stereofluorescence Microscope – FusionOptics and TripleBeam | |
| Sodium Chloride | Millipore (EMD) | 7760-5KG | Double PE sack. CAS No. 7647-14-5, EC Number 231-598-3 |
| Potassium Chloride | Millipore (EMD) | 1049380500 | Potassium chloride 99.999 Suprapur. CAS No. 7447-40-7, EC Number 231-211-8. |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 10035-04-8 |
| Magnesium Sulfate (Anhydrous) | Millipore (EMD) | MX0075-1 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Number 231-298-2 |
| Methylene Blue | Millipore (EMD) | 284-12 | Glass bottle; 25 g. Powder, Certified Biological Stain |
| Sodium Bicarbonate | Millipore (EMD) | SX0320-1 | Poly bottle; 500 g. Powder, GR ACS. CAS No. 144-55-8, EC Number 205-633-8 |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629-25G | >98%. CAS Number 103-85-5, EC Number 203-151-2 |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D8418-500ML | Molecular Biology grade. CAS Number 67-68-5, EC Number 200-664-3 |
| Tricaine Methanesulfonate | Western Chemical Inc. | MS222 | Tricaine-S |
| Low-Melt Agarose | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g |
| Open Bath Chamber | Warner Instruments | RC-40HP | High Profile |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circle cover glass. 25 mm diameter |
| High Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | 2.0-lb. tube. DOW CORNING CORPORATION 1658832 |
| Quick Exchange Platform | Warner Instruments | QE-1 | 35 mm |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20LZ-AL | 16.5 x 10 cm |
| TC SP5 MP multi-photon microscope | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser | SpectraPhysics | ||
| Laser Safety Box | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Leica Application Suite X (LAS X) Software | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Software | Adobe | ||
| iMovie Version 10.1.4 Software | Apple |
References
- Barembaum, M., Bronner-Fraser, M. Early steps in neural crest specification. Sem Cell Dev Biol. 16, 642-646 (2005).
- Gage, P. J., Rhoades, W., Prucka, S. K., Hjalt, T. Fate maps of neural crest and mesoderm in the mammalian eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (11), 4200-4208 (2005).
- Minoux, M., Rijli, F. M. Molecular mechanisms of cranial neural crest cell migration and patterning in craniofacial development. Development. 137, 2605-2621 (2010).
- Trainor, P. A. Specification of neural crest cell formation and migration in mouse embryos. Sem Cell Dev Biol. 16, 683-693 (2005).
- Johnston, M. C., Noden, D. M., Hazelton, R. D., Coulombre, J. L., Coulombre, A. Origins of avian ocular and periocular tissues. Exp Eye Res. 29, 27-43 (1979).
- Bohnsack, B. L., Kahana, A. Thyroid hormone and retinoic acid interact to regulate zebrafish craniofacial neural crest development. Dev Biol. 373, 300-309 (2013).
- Chawla, B., Schley, E., Williams, A. L., Bohnsack, B. L. Retinoic acid and pitx2 regulate early neural crest survival and migration in craniofacial and ocular development. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol. , (2016).
- Trainor, P. A., Tam, P. P. L. Cranial paraxial mesoderm and neural crest cells of the mouse embryo-codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in branchial arches. Development. 121 (8), 2569-2582 (1995).
- Hong, C. S., Saint-Jeannet, J. P. Sox proteins and neural crest development. Sem Cell Dev Biol. 16, 694-703 (2005).
- Steventon, B., Carona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Sem Cell Dev Biol. 16, 647-654 (2005).
- Dressler, S., et al. Dental and craniofacial anomalies associated wth Axenfeld-Rieger syndrome with PITX2 mutation. Case Report Med. , 621984 (2010).
- Ozeki, H., Shirai, S., Ikeda, K., Ogura, Y. Anomalies associated with Axenfeld-Rieger syndrome. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 237 (9), 730-734 (1999).
- Strungaru, M. H., Dinu, I., Walter, M. A. Genotype-phenotype correlations in Axenfeld-Rieger malformation and glaucoma patients with FOXC1 and PITX2 mutations. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 228-237 (2007).
- Tumer, Z., Bach-Holm, D. Axenfeld-Rieger syndrome and spectrum of Pitx2 and Foxc1 mutations. Eur J Hum Genet. 17, 1527-1539 (2009).
- Schoner, K., et al. Hydrocephalus, agenesis of the corpus callosum, and cleft lip/palate represent frequent associations in fetuses with Peters plus syndrome and B3GALTL mutations. Fetal PPS phenotypes, expanded by Dandy Walker cyst and encephalocele. Prenat Diagn. 33 (1), 75-80 (2013).
- Aliferis, K., et al. A novel nonsense B3GALTL mutation confirms Peters plus syndrome in a patient with multiple malformations and Peters anomaly. Ophthalmic Genet. 31 (4), 205-208 (2010).
- Lesnik Oberstein, ., S, A., et al. Peters Plus syndrome is caused by mutations in B3GALTL, a putative glycosyltransferase. Am J Hum Genet. 79 (3), 562-566 (2006).
- Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
- Bohnsack, B. L., Kasprick, D., Kish, P. E., Goldman, D., Kahana, A. A zebrafish model of Axenfeld-Rieger Syndrome reveals that pitx2 regulation by retinoic acid is essential for ocular and craniofacial development. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (1), 7-22 (2012).
- Williams, A. L., Eason, J., Chawla, B., Bohnsack, B. L. Cyp1b1 regulates ocular fissure closure through a retinoic acid-independent pathway. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1084-1097 (2017).
- Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neual crest by regulation of Mitf. Dev Biol. 332 (2), 408-417 (2009).
- Dutton, K., Dutton, J. R., Pauliny, A., Kelsh, R. N. A morpholino phenocopy of the colourless mutant. Genesis. 30 (3), 188-189 (2001).
- Dutton, K. A., et al. Zebrafish colourless encodes sox10 and specifies non-ectomesenchymal neural crest fates. Development. 128 (21), 4113-4125 (2001).
- Kucenas, S., Takada, N., Park, H. C., Woodruff, E., Broadie, K., Appel, B. CNS-derived glia ensheath peripheral nerves and mediate motor root development. Nat Neurosci. 11, 143-151 (2008).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Denk, W., Delaney, K. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle developmnt to changes in retinoic acid and insulin-like growth factor signaling. PLoS ONE. 6, e22991 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Laio, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10:kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. J Vis Exp. (79), e50525 (2013).
- Lopez, A. L. R., Garcai, M. D., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Live confocal microscopy of the developing mouse embryonic yolk sac vasculature. Methods Mol Biol. 1214, 163-172 (2015).
- McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4D confocal microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods Enzymol. 476, 351-377 (2010).
