Multi-fotone Time Lapse Imaging per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione della migrazione di cellule neurali della cresta negli embrioni di Zebrafish
Summary
Una combinazione delle tecniche ottiche avanzate di scansione microscopia con lungo l’eccitazione di fluorescenza multi-fotone lunghezza d’onda del laser è stata implementata per catturare immagini ad alta risoluzione, tridimensionale, in tempo reale della migrazione dalla cresta neurale in embrioni di zebrafish di Tg (foxd3:GFP) e Tg (sox10:EGFP).
Abstract
Occhio congenita e anomalie craniofacciali riflettono imprevisti nella cresta neurale, una popolazione transitoria di migratori cellule staminali che danno origine a numerosi tipi di cellule in tutto il corpo. Comprensione della biologia della cresta neurale è stata limitata, che riflette una mancanza di modelli geneticamente trattabili che possono essere studiati in vivo e in tempo reale. Zebrafish è un modello di sviluppo particolarmente importante per lo studio di popolazioni di cellule migratorie, come la cresta neurale. Per esaminare la migrazione dalla cresta neurale nell’occhio in via di sviluppo, una combinazione delle tecniche ottiche avanzate di scansione microscopia con eccitazione di fluorescenza di multi-fotone lunghezza d’onda del laser è stata implementata per catturare video ad alta definizione, tridimensionali, in tempo reale dell’occhio in via di sviluppo negli embrioni di zebrafish transgenici, vale a dire Tg (sox10:EGFP) e Tg (foxd3:GFP), come sox10 e foxd3 è stati dimostrati in numerosi modelli animali di regolare differenziazione iniziale dalla cresta neurale e probabilmente rappresentano gli indicatori per le cellule della cresta neurale. Time-lapse di immagini multi-fotone è stato utilizzato per discernere il comportamento e schemi migratori delle due popolazioni di cellule neurali della cresta che contribuiscono al precoce sviluppo dell’occhio. Questo protocollo fornisce informazioni per la generazione di video time-lapse durante la migrazione dalla cresta neurale di zebrafish, come esempio e possa essere applicato per visualizzare lo sviluppo precoce di molte strutture in zebrafish e altri organismi di modello.
Introduction
Malattie congenite dell’occhio possono causare la cecità di infanzia e spesso sono dovuti ad anomalie della cresta neurale cranica. Cellule della cresta neurale sono cellule staminali transitorie che derivano dal tubo neurale e formano numerosi tessuti in tutto il corpo. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 cellule della cresta neurale, derivate dal prosencefalo e mesencefalo, danno luogo all’osso e la cartilagine del midface e regioni frontali e l’iride, cornea, trabecolato e sclera nel segmento anteriore dell’occhio. 4 , 6 , 7 , 8 cellule neurali della cresta da romboencefalo forma che il pharyngeal arches, mascella e tratto di efflusso cardiaco. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 studi hanno evidenziato i contributi della cresta neurale all’oculare e perioculare sviluppo, sottolineando l’importanza di queste cellule in sviluppo dell’occhio dei vertebrati. Infatti, la rottura di differenziazione e migrazione delle cellule neurali della cresta condurre ad anomalie cranio-facciali ed oculari come osservato nella sindrome di Axenfeld-Rieger e sindrome di Peters Plus. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 in tal senso, una comprensione globale della migrazione, proliferazione e differenziazione di queste cellule della cresta neurale fornirà approfondimenti le complessità sottostanti malattie congenite dell’occhio.
Zebrafish è un organismo potente modello per studiare lo sviluppo oculare, come le strutture dell’occhio zebrafish sono simili alle loro controparti dei mammiferi, e molti geni sono evolutivamente conservate tra zebrafish e mammiferi. 18 , 19 , 20 inoltre, embrioni di zebrafish sono trasparenti e ovipari, facilitando la visualizzazione di sviluppo dell’occhio in tempo reale.
Espansione sul lavoro precedentemente pubblicato,6,7,20 il modello migratore delle cellule della cresta neurale è stata descritta usando la fluorescenza multi-fotone time-lapse di imaging su linee di zebrafish transgenici etichettati con la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo trascrizionale di SRY (regione dideterminazione Y)-scatola 10 (sox10) o Forkhead Box D3 nelle regioni regolatrici del gene (foxd3). 21 , 22 , 23 , 24. fluorescenza multi-fotone time-lapse imaging è una tecnica potente che combina le avanzate tecniche ottiche di microscopia con lungo l’eccitazione di fluorescenza di multi-fotone lunghezza d’onda di catturare immagini ad alta risoluzione, tridimensionale di esemplari con fluorofori etichettati di scansione laser. 25 , 26 , 27 l’uso del laser multi-fotone presenta chiari vantaggi rispetto la microscopia confocale standard, tra cui aumentata del tessuto vaginale e candeggio fluoroforo in diminuzione.
Utilizzando questo metodo, due popolazioni distinte delle cellule della cresta neurale varia in tempi di migrazione e percorsi migratori erano cellule della cresta neurale discriminata, vale a dire foxd3-positivo nel mesenchima periocular e occhio in via di sviluppo e le cellule di cresta neurale sox10-positivi nel mesenchima craniofacial. Con questo metodo, viene introdotto un approccio per visualizzare la migrazione della migrazione oculare e craniofacial cresta neurale in zebrafish, che lo rende facile osservare regolamentato dalla cresta neurale migrazione in tempo reale durante lo sviluppo.
Questo protocollo fornisce informazioni per la generazione di video time-lapse durante lo sviluppo iniziale di occhio in Tg (sox10:EGFP) e zebrafish transgenici Tg (foxd3:GFP), ad esempio. Questo protocollo possa essere applicato per la visualizzazione ad alta risoluzione, tridimensionale, in tempo reale dello sviluppo iniziale di qualsiasi struttura oculare e craniofacial derivato dalle cellule della cresta neurale in zebrafish. Inoltre, questo metodo possa essere applicato per la visualizzazione dello sviluppo di altri tessuti ed organi in zebrafish e altri modelli animali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Time-lapse di immagini multi-fotone consente il monitoraggio in vivo di popolazioni cellulari transitori e migratori. Questa potente tecnica può essere utilizzata per studiare i processi embrionali in tempo reale, e nello studio presente, i risultati di questo metodo ha migliorato la conoscenza attuale di sviluppo e migrazione delle cellule neurali della cresta. Precedenti studi di imaging time-lapse in genere utilizzano la microscopia a scansione laser confocale. 29 , <sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Thomas Schilling per gifting gentilmente il pesce di Tg (sox10:eGFP) e Mary Halloran per gifting gentilmente il pesce(foxd3:GFP) Tg.
Materials
| Breeding Tanks with Dividers | Aquaneering | ZHCT100 | Crossing Tank Set (1.0-liter) Clear Polycarbonate with Lid and Insert |
| M205 FA Combi-Scope | Leica Microsystems CMS GmbH | Stereofluorescence Microscope – FusionOptics and TripleBeam | |
| Sodium Chloride | Millipore (EMD) | 7760-5KG | Double PE sack. CAS No. 7647-14-5, EC Number 231-598-3 |
| Potassium Chloride | Millipore (EMD) | 1049380500 | Potassium chloride 99.999 Suprapur. CAS No. 7447-40-7, EC Number 231-211-8. |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 10035-04-8 |
| Magnesium Sulfate (Anhydrous) | Millipore (EMD) | MX0075-1 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Number 231-298-2 |
| Methylene Blue | Millipore (EMD) | 284-12 | Glass bottle; 25 g. Powder, Certified Biological Stain |
| Sodium Bicarbonate | Millipore (EMD) | SX0320-1 | Poly bottle; 500 g. Powder, GR ACS. CAS No. 144-55-8, EC Number 205-633-8 |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629-25G | >98%. CAS Number 103-85-5, EC Number 203-151-2 |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D8418-500ML | Molecular Biology grade. CAS Number 67-68-5, EC Number 200-664-3 |
| Tricaine Methanesulfonate | Western Chemical Inc. | MS222 | Tricaine-S |
| Low-Melt Agarose | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g |
| Open Bath Chamber | Warner Instruments | RC-40HP | High Profile |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circle cover glass. 25 mm diameter |
| High Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | 2.0-lb. tube. DOW CORNING CORPORATION 1658832 |
| Quick Exchange Platform | Warner Instruments | QE-1 | 35 mm |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20LZ-AL | 16.5 x 10 cm |
| TC SP5 MP multi-photon microscope | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser | SpectraPhysics | ||
| Laser Safety Box | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Leica Application Suite X (LAS X) Software | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Software | Adobe | ||
| iMovie Version 10.1.4 Software | Apple |
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