Un protocolo para identificar con precisión y analizar sinapsis en rebanadas hippocampal mediante inmunofluorescencia se describe en este artículo.
En el cerebro, las sinapsis son uniones especializadas entre neuronas, determinando la fuerza y la extensión de la señalización neuronal. El número de sinapsis es estrictamente regulado durante el desarrollo y maduración neuronal. Lo importante, déficit en el número de sinapsis puede conducir a la disfunción cognitiva. Por lo tanto, la evaluación del número de sinapsis es parte integral de la neurobiología. Sin embargo, como las sinapsis son pequeñas y muy compactas en el cerebro intacto, la evaluación del número absoluto es un reto. Este protocolo describe un método para fácilmente identificar y evaluar la sinapsis en el hipocampales rebanadas roedores usando microscopia de la inmunofluorescencia. Incluye un procedimiento de tres pasos para evaluar las sinapsis en imágenes de microscopía confocal de alta calidad mediante el análisis de colocalización de proteínas pre- y postsinápticas en rebanadas hippocampal. También explica cómo el análisis se realiza y da ejemplos representativos de sinapsis tanto excitatorias como inhibitorias. Este protocolo proporciona una base sólida para el análisis de las sinapsis y se puede aplicar a cualquier investigación investigar la estructura y función del cerebro.
El cerebro humano está compuesto por aproximadamente 1014 sinapsis. Número de sinapsis es estrictamente regulado durante el desarrollo y la maduración del sistema nervioso central (SNC). En todo el desarrollo, el número de sinapsis es modulada por la sinaptogénesis y la poda para formar redes neuronales funcionales. Aprendizaje y la memoria son compatibles con la regulación del número de sinapsis y la fuerza, un proceso conocido como potenciación sináptica y depresión1. Lo importante es la estabilización de la sinapsis Maduritas es esencial para mantener las conexiones de red neuronal. Además, se han reportado déficits en la densidad de sinapsis en las primeras etapas de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA)2. Por lo tanto, la capacidad de identificar con precisión y evaluar el número de sinapsis es fundamental para la evaluación de la patología y fisiología cerebral.
La extrema densidad y naturaleza compacta de sinapsis hacen difícil estimar su número preciso en áreas del cerebro intacto. Sinapsis químicas del sistema nervioso están hechas de dos neuronas en aposición estrecha, separados por una hendidura sináptica3. La terminal presináptica o bouton sináptico, surge de un axón y consiste en vesículas acumuladas, que contienen neurotransmisores que definen la especificidad de una sinapsis, es decir, glutamato y ácido gamma – aminobutírico (GABA) para excitatorios y inhibitorio sinapsis, respectivamente. Las membranas de las vesículas contienen vesiculares transportadores específicos para cada neurotransmisor: glutamato vesicular transportador (vGlut) para el glutamato y el transportador vesicular de GABA (vGAT) para GABA. La terminal postsináptica es una estructura muy densa compuesta por varias proteínas, incluyendo proteínas andamio, receptores y moléculas de adhesión. En las sinapsis excitatorias, proteína 95 densidad postsináptica (PSD-95) es el más abundante andamio proteína4, modulación excitatoria N-methyl-D-aspartate(NMDA-) y receptor del ácido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionico (AMPA) funcionar, mientras que gephyrin anclas receptores inhibitorios a la terminal postsináptica inhibitoria5. En general, la especificidad de las proteínas en compartimientos de pre- y postsinápticos ayuda en la diferenciación y la identificación de subtipos de sinapsis.
La evaluación del número de sinapsis se puede realizar con diferentes técnicas. El más común es el uso de la microscopia electrónica (EM), que permite el análisis de la sinapsis en áreas del cerebro intacto y compacto con alta magnificación y resolución. Sin embargo, esta técnica es muy costosa, requiere preparación de muestras complicadas y es muy lento. Otras técnicas incluyen el uso de la matriz tomografía6, que tiene una gran desventaja en que requiere equipo especializado y costoso realizar el análisis. Además, líneas transgénicas expresando marcadores sinápticos específicos son útiles en evaluar la sinapsis número7, pero la generación de nuevas líneas puede ser restrictivo y costoso, y la sobreexpresión de proteínas puede resultar en no deseado fuera del objetivo fenotipos.
Debido a estas limitaciones y para simplificar, muchos investigadores evaluación número de sinapsis por examinar los niveles de la proteína sináptica total. Sin embargo, puede observarse pérdida de sinapsis antes de cambios sustanciales en la proteína, como estructural remodelación sináptica en la dispersión de aposición pre o postsináptica, con la no degradación de proteínas sinápticas. Además, en AD, los niveles de proteínas sinápticas son reducidas siguientes sinapsis degeneración o muerte neuronal8,9. La cuantificación de los niveles totales no permite esta distinción. Por lo tanto, es necesario desarrollar un método confiable, accesible y preciso para la evaluación del número de sinapsis en el cerebro.
En este artículo describimos cómo bien identificar y determinar el número de sinapsis usando microscopia de la inmunofluorescencia en rebanadas de hipocampo cerebral de roedor. Las sinapsis son definidas por la colocalización de marcadores previos y post sinápticos que aparecen en una distribución de punteado. Demostramos la validez de esta técnica a través del estudio de Wnt de señalización en el cerebro. Wnts son proteínas de secreción importantes para la formación, eliminación y mantenimiento de las sinapsis. La inducción en vivo de un antagonista de la secretada de la cascada de Wnt, Dickkopf-1 (Dkk1), conduce a la pérdida sináptica excitatoria conservando las sinapsis inhibitorias en el hipocampo10. Ilustramos la identificación y conteo de sinapsis inhibitorias y excitatorias en rebanadas de hipocampales de un ratón adulto expresando Dkk1 y resaltar la transferencia de esta técnica a otros tipos de preparaciones de cultivo de tejidos.
La evaluación precisa del número de sinapsis es fundamental en el campo de la neurociencia. Aquí, mostramos cómo evaluar la densidad de sinapsis en la región CA1 estrato radiatum rebanadas hippocampal como sistema modelo. La importancia con respecto a los métodos existentes se demuestra en nuestro reciente artículo de investigación sobre el efecto de la deficiencia de Wnt en el hipocampo y donde también se evaluó el número de sinapsis por la solo-sección EM10. La magnitud de la pérdida de sinapsis son similares entre la solo-sección EM y la rebanada de cerebro método descrito aquí10. Por lo tanto, este hallazgo demuestra la exactitud y fiabilidad de la técnica.
Lo importante, una limitación de la solo-sección EM y sinapsis de inmunotinción, tal como se presenta aquí, es la incapacidad para estimar con precisión el número de sinapsis absoluta para una región específica del cerebro. De hecho, es importante identificar cualquier cambio morfológico global, como cambios en el volumen total podrían tener un impacto número sináptica. Otra limitación es que ciertos anticuerpos son menos eficientes en la coloración de las regiones del cerebro intacto, parcialmente debido a la extrema densidad de conexiones sinápticas. Experimentamos mayor calidad coloración de vGlut1 y gephyrin usando esta rodaja preparación y subsiguiente fijación de PFA para un máximo de 1 h, en comparación con la fijación inmediata de todo el cerebro en PFA (figura 2). El último conducido a tinción sináptica agrupada, con agujeros en el tejido. Sin embargo, la penetración de anticuerpos vGlut1 todavía está restringida en ambos métodos (un par de decenas de micras). No superar esta limitación, incluso con el anticuerpo de mayor incubación, pero proporcionando la penetración de anticuerpos es mayor que la profundidad total que es reflejada, no debe ser influencia en el resultado final. Además, se debe tener especial cuidado para asegurarse de que la tinción es incluso a lo largo de toda la pila adquirida.
En nuestro estudio, hemos querido distinguir excitatorio de la sinapsis inhibitorias. Por lo tanto, elegimos vGlut1/PSD-95 y vGAT/gephyrin, respectivamente, como estas proteínas son altamente expresadas en el hipocampo del ratón adulto y son específicas de cada sinapsis subtipo4,5. Otros marcadores sinápticos inhibitorias y excitatorias podrían se han utilizado para identificar cada sinapsis respectivos, tales como enriquecido en cada sinapsis, incluyendo receptores NMDA y de AMPA para los receptores excitatorios y GABAA Receptores de las sinapsis inhibitorias. Otros neurotransmisores o neuromoduladores pueden también identificarse con nuestro protocolo, garantizar que los anticuerpos específicos están disponibles, como se muestra para las sinapsis dopaminérgicas en el estriado22. Además, reduce el grosor de cada loncha a 120 μm puede superar parcialmente la baja cantidad de muestras obtenidas con láminas agudas, que es imprescindible para los estudios de las estructuras pequeñas del cerebro como la amígdala.
Futuras aplicaciones de nuestro protocolo podrían aplicarse en el estudio de diversas áreas del cerebro y trastornos. Por ejemplo, en el cuerpo estriado (una región del cerebro asociada con la enfermedad de Parkinson), una combinación de vGlut2/PSD-95 o vGlut1/PSD-95 se puede usar para diferenciar entre las sinapsis excitatorias de aferentes procedentes de la corteza o tálamo, y22.
En conclusión, hemos demostrado un método fiable para examinar el número de sinapsis en los tejidos del cerebro usando marcadores previos y postsinápticos para definir una sinapsis. Pasos críticos incluyen la preparación de buenas rebanadas hippocampal, un tiempo de fijación de hasta 1 hora en PFA, la aplicación suficiente de medio de montaje, el uso de anticuerpos confiables, ajustes de imagen apropiado de adquisición y detección rigurosas puncta sináptica. En última instancia, este método es relativamente rápido y es fácilmente reproducible por cualquier laboratorio que tienen acceso a un microscopio confocal.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el MRC, UE FP7, ARUK, Wellcome Trust y Parkinson UK. También nos gustaría agradecer a la Sra. Johanna Buchler por su aportación de imágenes confocales y los miembros del laboratorio por su aportación constructiva en el manuscrito y la metodología de.
Vibratome | Leica | VT1000S | |
Primary antibody | Millipore | AB5905 | vGlut1 (1:2000) |
Primary antibody | Thermo Scientific | MA1-046 | PSD-95 (1:500) |
Primary antibody | Synaptic Systems | 131 004 | vGAT (1:500) |
Primary antibody | Synaptic Systems | 147011 | Gephyrin (1:500) |
Primary antibody | Abcam | ab5392 | MAP2 (1:10000) |
Secondary antibody | Jackson Laboratories | 706-545-148 | Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600) |
Secondary antibody | Abcam | ab175470 | Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600) |
Mounting medium | SouthernBiotech | 00-4958-02 | Fluoromount-G |
Confocal Microscope | Olympus | NA | FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%. |
Analysis software | PerkinElmer | NA | Volocity |
Scalpel | Swann-Morton | 203 | No 11 |
Super Glue | Loctite | 1446875 | |
95% O2, 5% CO2 | BOC | NA | Cylinder |
24-well plate | Corning | 3524 | |
Glass slides | Thermo | 7107 | 08-1.0mm thick |
Petri Dish | Corning | 430167 | |
iDkk1 mice | N/A | N/A | Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKIIα rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKIIα rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents for solutions: | |||
NaCl | Sigma | V800372 | |
KCl | Sigma | P9333 | |
Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
Ca2Cl | Sigma | 223506 | |
Mg2Cl | Sigma | M9272 | |
NaH2PO4 | Sigma | 71505 | |
Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
D-Glucose | Sigma | G5767 | |
Sucrose | Sigma | S8501 | |
Triton-X | Sigma | T8787 | |
Donkey Serum | Millipore | S30-100ml | |
PFA | Sigma | P6148 |