Использование рекомбинантных комаров Densovirus как вектор доставки генов для функционального анализа генов в личинки комаров

Москиты таких заболеваний, как малярия, лихорадка денге, лихорадка Зика и желтой лихорадки, являются проблемы международного общественного здравоохранения, которые по-прежнему приходится значительная часть глобального инфекционных заболеваний бремя^1,2. Обычных инсектицидов, которые были использованы в ответ на векторы, являются одним из основных компонентов стратегии устойчивого комплексного Москито управления для профилактики болезней, переносимых комарами. Однако такие стратегии оказались относительно неэффективными или нежелательным из-за связанного негативного экологического воздействия, а также эволюция сопротивления в Москито населения^3,4. По этим причинам существует настоятельная необходимость в альтернативных методов комаров, управления и использования трансгенных методов для производства стерильных мужской комаров и выпуска устойчивостью возбудителя комаров возникли как перспективных новых стратегий управления. Для разработки эффективных новых управления методы, такие, как безопасные и эффективные подходы в vivo гена доставки, всесторонний анализ функции гена комаров не требуется.

Прямые микроинъекции плазмидной ДНК, двойной мель РНК (dsRNA) или малые интерферирующие РНК (siRNA) является наиболее часто используемым в vivo гена метод доставки в комаров. В самом деле производства трансгенных штаммов комаров по-прежнему полагаются на процесс эмбриона микроинъекции^5,6,7. Однако микроинъекции имеет ряд ограничений. Во-первых этот метод является технически сложным и включает в себя сложные процедуры. Во-вторых инъекций вызывает физическое оскорбление эмбриона, личинок, куколок и взрослых, который непосредственно влияет на жизнеспособность организма целевой. В-третьих это трудно иммобилизации личинок комаров для микроинъекции потому, что большинство живут в водной среде обитания и обладают характерной извиваясь движения. В-четвертых размер 1^st-2^nd instar личинки 10 – 20 раз меньше, чем 4^го возраста и старше личинок и смазывают бывшего более тонкие. Эти особенности делают трудно манипулировать 1^st-2^nd instar личинки по сравнению с теми в старых этапов. Вместе, эти факторы способствуют сокращению впрыск выживаемости для личинок (около 5%), по сравнению с⁸взрослых. Систем на базе вирусный были разработаны для преодоления барьеров, связанных внеклеточные и внутриклеточных. Эти системы имеют преимущества простой манипуляции, высокая электромеханической эффективности, долгосрочные и надежные уровней экспрессии и способность производить постоянные эффекты в естественных условиях. Таким образом Джин, систем доставки, используя ретровирусы, lentiviruses и аденовирусы были широко используется модель видов и inmammalian клеточных линий. Система вирусного выражение синдбис были ранее использованы для анализа функции гена в взрослых комаров; Помимо проблем биобезопасности однако, инъекции-прежнему необходимый процесс для вирусной инфекции⁹. Несмотря на то, как метод возможности доставки перорального путем замачивания личинок в решении двуцепочечной ДНК уже сообщалось ранее, она непригодна для малых РНК функция анализа¹⁰. Таким образом методы эффективные вирусный доставки по-прежнему должны быть разработаны для комаров.

Комар densoviruses (MDVs) являются частью подсемейство Densovirinae Parvoviridae, и все, но один падения в род Brevidensovirus¹¹. MDV вирионы не охватило и состоят из одноцепочечной ДНК (ssDNA) генома и икосаэдра капсид (20 Нм в диаметре). Вирусного генома находится примерно в 4 kb в размер и реплицируется внутри ядер клеток хозяина. MDVs относительно устойчивы в окружающей среде и показать узкие хозяйского диапазона с высокой точностью для комаров. Эти вирусы имеют потенциал для распространения и сохранения естественно популяции комаров и может вторгнуться почти все органы и ткани этих насекомых, в том числе средняя, Malpighian трубочки, жир тела, мускулатура, нейронов и слюнных желез¹².

Нетронутыми MDV геномов может быть subcloned в векторы плазмиды производить на основе плазмида инфекционных клоны; когда эти клоны доставляются в клетки комаров, вирусного генома извлекается из вектор плазмиды, и производятся инфекционных вирусных частиц. Потому что MDV имеет небольшой ssDNA генома, инфекционные клонов легко построены и вирусного генома могут быть легко манипулировать^11,13. Эти характеристики делают MDV ценным агентом для изучения биологии комаров. Однако, потому что почти все из вирусного генома имеет важное значение для вирусного распространения, создание рекомбинантных вируса путем замены или вставки чужеродных генов приводит к потере вирусный упаковки или репликации способностей, который создает барьером для развития MDVs как ген доставки векторов. Здесь мы сообщаем, что с помощью искусственных intronic малых РНК выражение стратегии для разработки не дефектных rAaeDV в vivo РНК системы доставки, которая имеет преимущества легко плазмида строительство и поддержание функциональной вирус, который может производить стабильное и долгосрочное выражение в клетки хозяина без необходимости дикого вируса. Кроме того этот метод позволяет легко трансдукции личинок.

В этом исследовании описываются протоколы для следующих шагов: 1) дизайн rAaeDVs кодирования кассета intronic выражение малых РНК, 2) производство рекомбинантных вирусных частиц с помощью упаковки ячейки C6/36 линия, 3) количественный анализ клеток бесплатно геном rAaeDV копировать номера и 4) инфекции личинок А.е. albopictus путем прямого введения в организм воды личиночной обитания вируса. В целом эта работа продемонстрировал, что конкретные малые РНК или целевых генов может оверэкспрессировали или сбил в личинки комаров с помощью разработанной системы доставки MDV.