أفقي جبل كامل: A معالجة الرواية والتصوير بروتوكول للثدي، ثلاثة-- الأبعاد الأنسجة عبر-- أقسام الجلد
Summary
يقدم هذا العمل معالجة جديدة وبروتوكول التصوير لسميكة، ثلاثي الأبعاد الأنسجة المقطع العرضي التحليل الذي يتيح الاستغلال الكامل للطرائق التصوير متحد البؤر. هذا البروتوكول يحافظ على المستضد ويمثل نظاما قويا لتحليل الأنسجة الجلد وأنواع الأنسجة الأخرى يحتمل أن تكون.
Abstract
يمكن أن يكون تجهيز الأنسجة ذات الاهتمام لتوليد صورة المجهرية التي تدعم حجة علمية تحديا. الحصول على الصور المجهرية عالية الجودة لا تعتمد اعتمادا كليا على نوعية المجهر، ولكن أيضا على أساليب معالجة الأنسجة، والتي غالبا ما تنطوي على إجراءات حاسمة متعددة أو خطوات. وعلاوة على ذلك، أنواع الخلايا الوسيطة في الجلد والأنسجة الأخرى تمثل تحديا جديدا لإعداد الأنسجة والتصوير. هنا، نقدم عملية كاملة، من حصاد الأنسجة إلى المجهري. تقنية لدينا، ودعا "جبل كامل الأفقي،" هو أن المبتدئين يمكن أن تصبح بسرعة يتقن في والتي تسمح للحفاظ على مستضد والكشف في 60-300 ميكرون سميكة أقسام قطع مع ناظم البرد. أقسام من هذا سمك توفر تصور معزز من الأنسجة المعمارية المصغرة في بيئة ثلاثية الأبعاد. وبالإضافة إلى ذلك، بروتوكول يحفظ خلايا الوسيطة بطريقة تعزز جودة الصورة عندمامقارنة مع ناظم البرد القياسية أو أقسام البارافين، وبالتالي زيادة فعالية وموثوقية المناعية. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول سوف تستفيد جميع المختبرات التي تصور الجلد، وربما الأنسجة والأعضاء الأخرى.
Introduction
توفر ثورة معدات التصوير المجهري أدوات تصوير متطورة وعالية الدقة. ومع ذلك، عند الحصول على صورة مجهرية من المقطع العرضي الأنسجة ثلاثية الأبعاد كاملة (3D)، وإعداد العينات تحديات كبيرة ويمكن أن يكون العامل المحدد في تحديد جودة الصورة. كل خطوة منفصلة تستحق دراسة متأنية من أجل الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة واستضداد البروتينات المستهدفة، للحد من التحف التي يسببها التصنيع، وتحقيق أقصى قدر من جودة الصورة النهائية. على سبيل المثال، والتحليل التقليدي للجلد يتطلب صورة مع نظرة للبشرة والأدمة، مع بصيلات الشعر التي توجه بشكل صحيح، مما يسمح للتحليل التشريحي للمساهمة مقصورة الخلايا الجذعية في توازن الجلد 1 ، 2 . وهذا يتطلب تركيزا دقيقا على كيفية تضمين الجلد وقسمه. الأهم من ذلك، بصيلات الشعر يمكن أن يكون أكثر سمكامن 100 ميكرون، الذي يفوق كثيرا البارافين القياسية أو سمك القسم المجمدة، مما أدى إلى انخفاض مستوى التحليل مقارنة يتصاعد كله أو سميكة المقاطع العرضية 3 ، 4 ، 5 .
مجتمعة، كل خطوة من إعداد العينات للتحليل المجهري هو محدد حاسم من شأنها أن تؤثر على تحليل الصور. هنا، يتم تقديم بروتوكول معالجة الرواية لسميكة، 3D الأنسجة المقطع العرضي التحليل، الذي نسميه "جبل كامل الأفقي،". بروتوكول يحافظ للغاية مستضد وتمكن من الاستغلال الكامل للأقسام سميكة من الجلد باستخدام معدات التصوير مبائر القياسية. هذا هو دليل كامل لاستخدام الجلد للأنسجة سميكة تجهيز المقطع العرضي والتصوير، بما في ذلك حصاد الأنسجة و بارافورمالدهيد (بفا) – الحفاظ على الحفظ بالتبريد (الخطوة 1)، وتوليد 100 ميكرون سميكة الأنسجة المقاطع العرضية مع ناظم البرد 2)، و إمونوفلورزنت وسم تصاعد (الخطوات 3 و 4). النتائج ممثل مقارنة الصور متحد البؤر من اثنين متميزة تقنيات إعداد النسيجي – كريوسكتيونينغ الكلاسيكية وسميكة، 3D الأنسجة عبر المقسمة تسليط الضوء على مزايا "يتصاعد كله الأفقي" للمستخدم المحتمل لهذا البروتوكول.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here, we present the “horizontal whole mount” technique, which has several advantages over classical frozen sections. One advantage of our technique is that it can easily be performed with standard histology equipment and a confocal microscope. Second, the tissue integrity is preserved in a superior manner when compared to standard cryosections. For example, adipocytes within the hypodermal layer (i.e., dermal white adipocytes (DWAT))9 are severely disrupted in standard cryosections, which makes studying tissues that are adipose-laden impossible. Our technique allows for the full analysis of the adipocytes in this layer and may be adapted to other tissues with high adipocyte contents. Furthermore, this allows for the improved detection of mesenchymal cells in lineage-tracing studies 2,10.
Standard cryosections, by their very nature, can never reveal the true 3D aspects of a tissue through confocal microscopy. This means that thicker sections are advantageous in the analysis of skin, since hair follicles, as well as their substructures, can traverse a depth that exceeds the standard thickness of 10 µm used in classical crysosections. We are intrigued that other tissues, such as the intestine and brain, for example, possess similar challenges with regard to viewing the tissue as a 3D structure2,7,11,12,13. Intriguingly, our technique has already been shown to be beneficial for use in certain applications in the intestines14. We believe that our horizontal whole-mount protocol has the potential be applied to any other tissue requiring 3D analysis.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفون الرعاية من الحرارية فيشر العلمية وشكرا مركز التصوير نيكون في كلية كينغز لندن للحصول على الدعم أثناء التقاط الصور متحد البؤر.
Materials
| PBS | homemade | ||
| Gelatin, from cold water fish skin | Sigma | G7765 | 250ML |
| Glycerol | BDH Laboratory Supplies | 444482V | |
| O.C.T. compound | VWR chemicals | 361603E | |
| Peel-A-Way embedding molds | Sigma | E6032-1CS | Square S-22 |
| Non-Fat Powdered Milk | Bio Basic Inc. | NB0669 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | 500ML |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
| FITC Rat Anti-Human CD49f | BD Pharmingen | 555735 | |
| Mouse/Rat Integrin alpha 8 Antibody | R&D Systems | AF4076 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG | Life Technologies | A21208 | |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-goat IgG | Life Technologies | A21432 | |
| CryoStar NX70 | Thermo Fisher Scientific | ||
| 100mm Culture dishes | |||
| Disposable scalpels | Swann-Morton | Ref 0501 | |
| pointed metal forceps | |||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR | 211-2130 | |
| 12 Well plates | Sigma | CLS3513 | |
| Dissecting microscope | Nikon | ||
| 20 ul and 1000 ul Pipette | Gilson | ||
| 1000µl XL Graduated TipOne Filter Tip (Sterile) | Star Lab | S1122-1830 | |
| 20µl Bevelled TipOne Filter Tip (Sterile) | Star Lab | S1120-1810 | |
| Rocking shaker plate | |||
| Microscope slides, menzel Glaeser | Thermos Scientific | 631-9483 | Superfrost Plus |
| Cover Glasses, Menzel Glaeser | Thermos Scientific | MENZBB024060AB | 24 x 60 mm |
| Confocal microscope | Nikon |
References
- Plikus, M. V., et al. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration. Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).
- Zhang, Y. V., Cheong, J., Ciapurin, N., McDermitt, D. J., Tumbar, T. Distinct self-renewal and differentiation phases in the niche of infrequently dividing hair follicle stem cells. Cell Stem Cell. 5 (3), 267-278 (2009).
- Jensen, U. B., Lowell, S., Watt, F. M. The spatial relationship between stem cells and their progeny in the basal layer of human epidermis: a new view based on whole-mount labelling and lineage analysis. Development. 126 (11), 2409-2418 (1999).
- Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Driskell, R. R., Giangreco, A., Jensen, K. B., Mulder, K. W., Watt, F. M. Sox2-positive dermal papilla cells specify hair follicle type in mammalian epidermis. Development. 136 (16), 2815-2823 (2009).
- Niculescu, C., et al. Conditional ablation of integrin alpha-6 in mouse epidermis leads to skin fragility and inflammation. Eur J Cell Biol. 90 (2-3), 270-277 (2011).
- Fujiwara, H., et al. The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche. Cell. 144 (4), 577-589 (2011).
- Desciak, E. B., Maloney, M. E. Artifacts in frozen section preparation. Dermatol Surg. 26 (5), 500-504 (2000).
- Driskell, R., Jahoda, C. A., Chuong, C. M., Watt, F., Horsley, V. Defining dermal adipose tissue. Exp Dermatol. 23 (9), 629-631 (2014).
- Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
- Snippert, H. J., Schepers, A. G., Delconte, G., Siersema, P. D., Clevers, H. Slide preparation for single-cell-resolution imaging of fluorescent proteins in their three-dimensional near-native environment. Nat Protoc. 6 (8), 1221-1228 (2011).
- Sada, A., et al. Defining the cellular lineage hierarchy in the interfollicular epidermis of adult skin. Nat Cell Biol. 18 (6), 619-631 (2016).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Tetteh, P. W., et al. Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
