Il s’agit d’un régime riche en graisses alimentation protocole pour provoquer l’obésité chez la drosophile, un modèle pour la compréhension des mécanismes moléculaires fondamentaux impliqués dans la lipotoxicité. Il fournit également un dosage de triacylglycérides à haut rendement pour mesurer l’accumulation de graisse dans la drosophile et potentiellement d’autres modèles (insectes) dans diverses conditions alimentaires, environnementale, génétiques ou physiologiques.
Maladie cardiaque est la première cause de mortalité humaine dans le monde. Nombreuses études ont montré des liens solides entre l’obésité et de défaillance cardiaque chez les humains, mais plus d’outils et les efforts de recherche sont nécessaires pour mieux élucider les mécanismes impliqués. Pour plus d’un siècle, le modèle génétiquement très docile de la drosophile a contribué à la découverte de gènes clés et les voies moléculaires qui s’est avéré être hautement conservée à travers les espèces. De nombreux processus biologiques et les mécanismes de la maladie sont fonctionnellement conservées chez la mouche, tels que le développement (par exemple, plan du corps, coeur), le cancer et les maladies neurodégénératives. Récemment, l’étude de l’obésité et des pathologies secondaires, tels que les maladies cardiaques chez les organismes modèles, a joué un rôle critique dans l’identification des régulateurs clés impliqués dans le syndrome métabolique chez l’homme.
Ici, nous vous proposons d’utiliser cet organisme modèle comme un outil efficace pour induire l’obésité, par exemple, l’accumulation excessive de graisse et élaboration d’un protocole efficace pour surveiller la teneur en matière grasse sous la forme de l’accumulation de TAGs. Outre le hautement conservée, mais moins complex génome, la mouche a également une durée de vie courte pour une expérimentation rapide, combinée à la rentabilité. Ce document fournit un protocole détaillé pour haute graisse Diet (HFD) alimentation chez la drosophile pour provoquer l’obésité et un dosage de triacylglycérides (TAG) à haut débit pour mesurer l’augmentation connexe de la teneur en matière grasse, dans le but d’être hautement reproductible et efficace pour le dépistage génétique ou chimique à grande échelle. Ces protocoles offrent de nouvelles opportunités pour efficacement enquêter sur les mécanismes de régulation impliquées dans l’obésité, ainsi que fournir une plate-forme standardisée pour recherche de découverte de médicaments pour le test rapide de l’effet de médicaments potentiels sur le développement ou prévention de l’obésité, le diabète et les maladies métaboliques associées.
Nous sommes dans un moment où l’obésité et ses contraintes économiques associés, est un problème mondial1. Deux de chaque trois Américains sont en surpoids ou obèses présentant des pathologies cardiaques connexes, la principale cause de décès au sein de la population adulte2. Nouvelles méthodes efficaces sont nécessaires pour enquêter adéquatement sur les composantes génétiques et moléculaires impliqués dans la régulation du syndrome métabolique à l’aide d’organismes modèles. Pour cette raison, nous choisissons la drosophile Drosophila modèle parce qu’elle partage les processus biologiques élémentaires avec les mammifères, y compris les souris et les humains3,4,5,6. Génome de la drosophileest hautement conservée au cours de l’évolution, mais dans l’ensemble beaucoup plus petites avec moins de duplication génique et complexité métabolique, ce qui est idéal pour la compréhension des mécanismes fondamentaux impliqués dans plusieurs maladies humaines4 , 7 , 8. en outre, caractéristique des processus effectué par le tissu adipeux, le tube digestif et pancréas sont représentés à la volée et médiation des fonctions de régulation dans le métabolisme de glucose et des lipides, par exemple, qui sont semblables aux êtres humains9, 10,11. En outre, les base voies moléculaires impliquées dans le contrôle de l’obésité, résistance à l’insuline et le diabète chez l’humain sont fonctionnellement conservés Drosophila melanogaster12,13,14 , 15 , 16. comme les organismes supérieurs, Drosophila a un cœur qui bat qui est formé au cours du développement par un processus similaire à celui des mammifères coeur3,17. Ainsi, le développement d’un SIH fiable alimentant le protocole et le dosage de TAG à haut débit, adaptés à des fins de dépistage efficace à l’aide de la boîte à outils génétiques de la drosophile, constituent un moyen important d’étudier et de comprendre les bases génétiques fondamentales maladies métaboliques complexes sous-jacentes.
La nourriture HFD lui-même est issue d’un aliment de mouche de laboratoire standard additionné d’huile de coco, qui est composée principalement d’acides gras saturés, connus pour être associés avec le syndrome métabolique18. Induisant l’obésité chez les modèles mammifères, tels que les rongeurs, peut prendre des mois19,20, notre HFD optimisé, protocole d’alimentation chez la drosophile efficacement et de façon reproductible augmente organismique de matière grasse dans une affaire de jours12,14. Ce protocole, en conjonction avec un essai de débit élevé TAG, permet le dépistage de masse efficace pour les effets de facteurs génétiques, les influences de l’environnement et les médicaments candidats à découvrir de nouveaux modulateurs du métabolisme des graisses. En conséquence, ces protocoles sont probables pertinents pour comprendre et combattre l’obésité et les pathologies humaines associées à l’obésité.
Le protocole alimentaire est polyvalent et peut être appliqué à l’étude les effets métaboliques et fonctionnelles du seul des acide gras saturé ou insaturé. L’utilisation de ce test de TAG à haut débit n’est pas limitée à d. melanogaster, mais peut être adaptée à une variété d’organismes petit modèle avec cuticule ou difficiles matrices extracellulaires (p. ex., autres espèces de drosophile , c. elegans et les autres nouveaux organismes invertébrés modèles) pour mesurer la teneur en matières grasses dans différentes conditions environnementales, génétiques ou physiologiques, à tout stade de développement, à l’âge adulte ou phase de maladie métabolique. Le TAG est basé sur une mesure colorimétrique d’une série de réactions enzymatiques qui dégradent les balises en acides gras, le glycérol, le glycérol 3-phosphate et enfin H2O2 qui réagit avec l’amino-4 antipyrine (4-AAP) et 3,5- dichloro-2-hydroxybenzène sulfonate (DHBS 3,5) pour produire un produit de couleur rouge qui est mesuré à l’aide d’un spectrophotomètre de 96 puits.
Induction de l’obésité chez la souris peut prendre des mois19,20. Chez les mouches, ce HFD, protocole d’alimentation permet d’induction de l’accumulation de graisse excédentaire dans une affaire de jours ou moins, entraînant des augmentations dans l’accumulation de graisse seulement après 18 h (voir Figure 2). HFD alimentation avec le protocole décrit augmente le glucose contenu 12 et diminue l…
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier Erika Taylor pour l’édition de ce manuscrit. Ce travail a été financé par des subventions accordées par le National Institutes of Health (P01 HL098053, P01 AG033561 et HL054732 R01) à R.B., un supplément de recherche postdoctorale (R01 HL085481) et la bourse (AAUW) à S.B.D. et aux dons de l’American Heart Association à S.B.D. et R.T.B.
Talboys Ball dropper/bead Dispenser | Talboys | #: 930150 | |
Talboys High Throughput Homogenizer | Talboys | #: 930145 | |
Grinding Balls, Stainless Steel | OPS Diagnostics, LLC | # GBSS 156-5000-01 | 5000 balls |
Masterblock 96 Well deep Microplates | Greiner Bio-One | # T-3058-1 | case of 80 plates |
Greiner 96 well microplate flat bottom | Sigma Aldrich | # M4436 | 40 plates |
Greiner CapMat for sealing multiwell plates | Sigma Aldrich | # C3606 | 50 sealing plates |
Reagent Reservoirs | Thomas Scientific | # 1192T71 | 12/PK |
Thermo Scientific Finnpipette 4661040 | Thermo Scientific | # 4661040 | 1-10 ul multipipette |
Thermo Scientific Finnpipette 4661070 | Thermo Scientific | # 4661070 | 30-300ul multipipette |
Thermo Scientific Finnpipette 4661020 | Thermo Scientific | #4661020 | 10-100ul multipipette |
Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3131-S | for 10 uL pipette |
Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3133-S | for 200 uL pipette |
Multichannel tips | Denville Scientific Inc | #P1125 | for 100 uL pipette |
Forceps | Roboz Surgical | # 5 Dumonts | Super fine forceps |
Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64 | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-00 | |
Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-49 | |
96-Well microplate Centrifuge | Hettich Zentrifugen | # Rotina 420R | |
Microplate Reader | Molecular devices | # SpectraMax 190 | |
Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator | Biostad | # 3527 | |
Infinity Triglycerides reagent | Thermo Scientific | # TR22421 | |
Triglyceride Standard | Stanbio | #2103 – 030 | |
Quick Start Bradford Protein Assay | Bio-RAD | # 500-0205 | 1x dye Reagent |
Coconut oil | Nutiva | # 692752200014 | 15 0z jar |
PBS 10X | Thermo Scientific | # AM9625 | 500 ml |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | # 9002-93-1 | |
Gas-permeable Foil | Macherey-Nagel | # 740675 | 50 pieces |
filter Paper | VWR | # 28317-241 | Pack of 100 |
Drosophila vials | Genesee Scientific | Cat #: 32-116SB | |
Quick Start Bovine Serum Albumin Standard | Bio-Rad | # 5000206 | |
FlyNap Anesthetic | Carolina | # 173025 | 100 mL |
Kimwipes Low-Lint | Uline | # S-8115 | 1-Ply, 4.4 x 8.4" |