Reprogrammierung primäre Fruchtwasser und Membrane Zellen zur Pluripotenz in Xeno-freien Bedingungen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Reprogrammierung von primären amniotische Flüssigkeit und Membran mesenchymalen Stammzellen in induzierte pluripotente Stammzellen unter Verwendung eines nicht-Integration von episomal Ansatzes in vollem Umfang chemisch definierten Bedingungen. Verfahren der Gewinnung, Kultur, Neuprogrammierung und Charakterisierung der daraus resultierenden induzierten pluripotenten Stammzellen durch strenge Methoden werden detailliert beschrieben.
Abstract
Autologe zellbasierte Therapien bekam einen Schritt näher an der Realität mit der Einführung von induzierten pluripotenten Stammzellen. Fetaler Stammzellen, wie Fruchtwasser und Membran mesenchymale Stammzellen, stellen eine einzigartige Art von undifferenzierten Zellen mit Versprechen in Gewebe-Engineering und Reprogrammierung in iPSC für zukünftige pädiatrische Interventionen und Stammzell-banking. Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt ein optimiertes Verfahren zur Gewinnung und Kultivierung primäre amniotischen Flüssigkeit und Membran mesenchymalen Stammzellen und generiert episomal induzierte pluripotente Stammzellen aus diesen Zellen in vollem Umfang chemisch definierte Kultur Bedingungen, die Nutzung von menschlichen rekombinante Vitronectin und E8 Medium. Charakterisierung der neuen Linien durch die Anwendung strenger Methoden – Durchflusszytometrie, konfokale Bildgebung, Teratom Bildung und transkriptionelle profiling – wird ebenfalls beschrieben. Die neu erzeugten Linien auszudrücken Marker von embryonalen Stammzellen – Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 – wobei negativ für die SSEA-1-Markierung. Die Zelllinien bilden darum in scid-Beige Mäuse in ca. 6-8 Wochen und die darum enthalten Gewebe repräsentativ für alle drei Mikrobeschichten. Transkriptionelle Profilierung der Linien mit dem Absenden globalen Ausdruck Microarray Daten zu einem Bioinformatic Pluripotenz Bewertung Algorithmus als alle Linien pluripotenten und daher ist dieser Ansatz eine attraktive Alternative zu Tierversuchen. Die neuen iPSC-Linien können problemlos in nachgeschalteten Experimente mit der Optimierung von Differenzierung und Tissue Engineering verwendet werden.
Introduction
Die Technologie von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) bringt über mögliche Zellersatztherapien, Krankheit, Medikament und Entwicklungsstörungen Modellierung und toxikologischen Screening1,2,3. -Ersatz-Therapien können konzeptionell durch Zelle Injektion erreicht werden, in-vitro-differenzierte Gewebe (z. B. kardiale Patches) Implantation oder geführte Regenerierung mittels Gewebetechnik. Fruchtwasser (AFSC) und Membran-Stammzellen (AMSC) sind eine ausgezeichnete Quelle von Zellen für diese Interventionen entweder direkt4,5,6,7 oder als ein Ausgangspunkt Zellpopulation Umprogrammierung in Pluripotenz8,9,10,11,12.
Frühe Ansätze verwendet nicht definierte Kultur-Systeme oder Neuprogrammierung Methoden, die beinhalten genomischen Integration von9,10,11,12konstruiert. Eine neuere Studie beschäftigt ein Xeno-freies Medium, obwohl eine weniger definierte Basalmembran Anlage Matrix (BMM) verwendet wurde, um iPSC aus amniotische Flüssigkeit Epithelzellen zu generieren. Teratom Bildung Assay war jedoch nicht in die Studie zusammen mit einer Fülle von in-vitro- und molekulare Daten enthalten. Amniotische flüssige epitheliale Zellen erwiesen sich als eine etwa 8-fold höhere Neuprogrammierung Effizienz im Vergleich zu Neugeborenen Fibroblasten13haben. In einer anderen Studie fanden mesenchymaler Stammzellen aus Fruchtwasser auch in iPSC mit einem viel höheren Wirkungsgrad12neu programmiert werden.
Pluripotente Stammzellen unterscheiden sich in Geweben repräsentativ für alle 3 Mikrobeschichten und somit das größte Potenzial haben. Pädiatrische Patienten könnten davon profitieren die Ernte, Neuprogrammierung und Tissue Engineering ihre autologe amniotische Flüssigkeit Stammzellen pränatal und perinatal amniotischen Membran-Stammzellen. Darüber hinaus konnte das relativ niedrige Niveau der Differenzierung von embryonalen Stammzellen (niedriger als adulte Stammzellen14,15) theoretisch helfen bei der Bewältigung des beobachteten Eigentumsvorbehalts epigenetische Voreingenommenheit von Quellzellen iPSC16.
Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll für die Umprogrammierung Fruchtwasser und Membran Stammzellen zur Pluripotenz in chemisch Xeno-freie E8 Medium für rekombinante Vitronectin17 (VTN) mit episomal Plasmide18definiert. Der Hauptvorteil der amniotischen Flüssigkeit und Membran-Zellen als eine Quelle der Zellen für eine Anpassung liegt in ihrer Verfügbarkeit Pre und perinatal und somit würde dieser Ansatz vor allem Forschung zugute, in pädiatrischen Gewebetechnik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die erste Phase der iPSC-Generation von fetalen Stammzellen beinhaltet die Gewinnung von die Quellzellen aus fetaler Gewebe, ihre Kultur, Ausbau und Einführung von episomal Neuprogrammierung Plasmide. Dieser Phase folgt eine Kulturdauer von ca. 14-18 Tage, bevor die ersten voll umprogrammierten Kolonien erweitert werden können. Die Abschlussphase ist Reifung der iPSC-Klone. Die ersten Gewinnung von Stammzellen amniotischen Membran wird mittels einer kombinierten mechanische und enzymatische Verdauung von der Amnion err…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den Fonds Medizinische Forschung an der UZH Forschungskredit der Universität Zürich, The SCIEX NMSCh unter Stipendien 10.216 und 12.176, der Schweizerischen Gesellschaft für Kardiologie, The Swiss National Science unterstützt. Stiftung unter Grant [320030-122273] und [310030-143992], das 7. Rahmenprogramm, Leben Ventil, Europäische Kommission unter Grant [242008], die Olga Mayenfisch Stiftung, die EMDO Stiftung, Gründungshilfe 2012 von der Universitätsklinik Zürich, und interne Finanzierung des Mitchell Cancer Institute.
Materials
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | tissue dissociation system, reagent kit, includes tissue dissociation tubes and tissue dissociation enzymes |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | tissue dissociation system, dissociator |
| Thermo Scientific™ Shandon™ Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm) | Thermo-Fisher | 3120032 | |
| 70 µm cell strainers | Corning | 10054-456 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo-Fisher | 32404014 | |
| rocking platform | VWR | 40000-300 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339652 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339650 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC-3156 | basal medium for AFMC medium |
| FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated) | Prospec Bio | CYT-218 | bFGF, supplement for AFMC medium |
| EGF Human, Pichia | Prospec Bio | CYT-332 | EGF, supplement for AFMC medium |
| LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant | Prospec Bio | CYT-022 | IGF, supplement for AFMC medium |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified | Thermo-Fisher | 10439024 | FBS |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo-Fisher | 15240062 | for primary AFSC/AMSC, for routine AFSC/AMSC it should not be necessary, do not use in medium for transfected cells! |
| Accutase cell detachment solution | StemCell Technologies | 07920 | cell detachment enzyme |
| CryoStor™ CS10 | StemCell Technologies | 07930 | complete freezing medium |
| PBS, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 10010023 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | 12362 | for plasmid isolation |
| pEP4 E02S EN2K | Addgene | 20925 | EN2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, Nanog+Klf4 |
| pEP4 E02S ET2K | Addgene | 20927 | ET2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4 |
| pCEP4-M2L | Addgene | 20926 | M2L, reprogramming factors c-Myc+LIN28 |
| NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000C | spectrophotometer |
| Neon® Transfection System | Thermo-Fisher | MPK5000 | transfection system, components: Neon pipette – transfection pipette Neon device – transfection device |
| Neon® Transfection System 10 µL Kit | Thermo-Fisher | MPK1025 | consumables kit for the Neon Transfection System, it contains: Neon tip – transfection tip Neon tube – transfection tube buffer R – resuspension buffer buffer E – electrolytic buffer |
| Stemolecule™ Sodium Butyrate | StemGent | 04-0005 | small molecule enhancer of reprogramming |
| TeSR-E8 | StemCell Technologies | 05940 | E8 medium |
| Vitronectin XF™ | StemCell Technologies | 07180 | VTN, stock concentration 250 µg/ml, used for coating at 1 µg/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer |
| CellAdhere™ Dilution Buffer | StemCell Technologies | 07183 | vitronectin dilution buffer |
| UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | dilute with PBS to 0.5 mM before use |
| EVOS® FL Imaging System | Thermo-Fisher Scientific | AMF4300 | LCD imaging microscope system |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | phase contrast cell culture microscope | |
| Pierce™ 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo-Fisher | 28908 | dilute to 4% with PBS before use, diluted can be stored at 2-8 °C for 1 week |
| Perm Buffer III | BD Biosciences | 558050 | permeabilization buffer, chill to -20 °C before use |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 557782 | isotype control for Oct3/4A, Nanog |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 557783 | isotype control for Sox2 |
| Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 561628 | |
| Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 560791 | |
| Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 562139 | |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 401617 | isotype control for TRA-1-60 |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401618 | isotype control for TRA-1-81 |
| Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 330613 | |
| Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330705 | |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 400129 | isotype control for SSEA-1 |
| Mouse IgG3, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401321 | isotype control for SSEA-4 |
| Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 323010 | |
| Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330407 | |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 488 | Jackson Immunoresearch | 115-606-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647 | Jackson Immunoresearch | 115-546-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| DAPI | Thermo-Fisher Scientific | D21490 | stock solution 10 mM, further dilute to 1:12.000 for a working solution |
| Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | basement membrane matrix (BMM) |
| scid-beige mice, female | Taconic | CBSCBG-F | |
| RNeasy Plus Mini Kit (50) | Qiagen | 74134 | RNA isolation kit |
| T-25 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156367 | |
| T-75 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156499 | |
| Nunc™ tissue-culture dish | Thermo-Fisher | 12-567-650 | 10 cm tissue culture dish |
| 6-well plates, tissue-culture treated | Thermo-Fisher | 140675 | |
| Neubauer counting chamber (hemacytometer) | VWR | 15170-173 | |
| Mr. Frosty™ Freezing Container | Thermo-Fisher | 5100-0001 | freezing container |
| FACS tubes, Round Bottom Polystyrene Test Tube, 5ml | Corning | 352058 | 5 ml polystyrene tubes |
| Eppendorf tubes, 1.5 ml | Thermo-Fisher | 05-402-96 | 1.5 ml microcentrifuge tubes |
| PCR tubes, 200 µl | Thermo-Fisher | 14-222-262 | |
| pipette tips, 100 to 1250 µl | Thermo-Fisher | 02-707-407 | narrow-bore 1 mL tips |
| pipette tips, 5 to 300 µl | Thermo-Fisher | 02-707-410 | |
| pipette tips, 0.1 to 10 µl | Thermo-Fisher | 02-707-437 | |
| wide-bore pipette tips, 1000 µl | VWR | 89049-166 | wide-bore 1 mL tips |
| glass Pasteur pipettes | Thermo-Fisher | 13-678-20A | |
| ethanol, 200 proof | Thermo-Fisher | 04-355-451 | |
| vortex mixer | VWR | 10153-842 | |
| chambered coverglass, 8-well, 1.5mm borosilicate glass | Thermo-Fisher | 155409 | glass-bottom confocal-grade cultureware |
| 22G needles | VWR | 82002-366 | |
| insulin syringes | Thermo-Fisher | 22-253-260 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixation of explanted teratomas |
| Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip | Illumina | BD-103-0204 | expression microarray, supported by PluriTest, discontinued by manufacturer |
| PrimeView Human Genome U219 Array Plate | Thermo-Fisher | 901605 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), soon to be supported by PluriTest |
| GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 Array | Thermo-Fisher | 902482 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), supported by CellNet, soon to be supported by PluriTest |
| PluriTest® | Coriell Institute | www.pluritest.org, free service for bioinformatic assessment of pluripotency, accepts microarray data – *.idat files from HT-12 v4 platform, soon to support U133, U219 microarray and RNA sequencing data | |
| CellNet | Johns Hopkins University | cellnet.hms.harvard.edu, free service for bioinformatic identification of cell type, including plutipotent stem cells, based on U133 microarray data – *.cel files, soon to support RNA sequencing data |
References
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