Métodos e dicas para administração intravenosa de vírus Adeno-associado aos ratos e avaliação do sistema nervoso Central transdução
Summary
Métodos para uma entrega de gene em larga escala do SNC em ratos são cobertos. Neste exemplo, o propósito é imitar uma doença que afeta a todo da medula espinhal. A transdução generalizada pode ser usada para fornecer uma proteína terapêutica ao SNC, desde uma única administração periférica.
Abstract
Vetores de vírus adeno-associado (AAV) são um reagente chave nas Neurociências para cluster regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR), optogenetics, cre-lox segmentação, etc. O objetivo deste manuscrito é ajudar o investigador a tentativa de transferência de genes de extenso sistema de nervoso central (SNC) em ratos através da injeção de veia de cauda de AAV. Expressão de larga escala é relevante para as condições com patologia generalizada, e um modelo do rato é significativo devido ao seu tamanho maior e fisiológicas semelhanças com os seres humanos em comparação com ratos. Neste aplicativo de exemplo, uma transdução neuronal em larga escala é usada para imitar uma doença neurodegenerativa que afeta toda medula espinhal, esclerose lateral amiotrófica (ela). A transdução de CNS eficiente em grande escala também pode ser usada para entregar fatores de proteínas terapêuticas em estudos pré-clínicos. Após um intervalo de expressão pós-injeção de várias semanas, são avaliados os efeitos da transdução. Para um vetor de controle de proteína verde fluorescente (GFP), a quantidade de GFP no cerebelo é estimada rapidamente e confiantemente por um programa básico da imagem latente. Para fenótipos motor doença que são induzidos pelo ALS relacionados resposta transacional de proteínas DNA-proteína obrigatória de 43 kDa (TDP-43), os défices são marcados por rotarod e reflexo de fuga. Além da modelagem de doença e terapia genética, existem diversas aplicações potenciais para o gene em larga escala como alvo descrito aqui. Expandido o uso deste método irá ajuda em acelerar testes nas neurociências e neurogenética de hipóteses.
Introduction
Vectores recombinantes vírus adeno-associado (AAV) são ferramentas indispensáveis para a investigação do CNS, porque eles são tão eficientes para transducing neurônios em vivo. Vetores AAV são muito versáteis para estudar diferentes transgenes e isoformas de proteínas, tecidos diferentes, espécies hospedeiras diferentes e diferentes vias de administração. Por exemplo, AAV pode ser administrado a ratos por um periférico, relativamente não-invasivo, injeção intravenosa para transduce neurônios em todo o CNS como o primeiro descrito em Foust et al e Duque et al (veja papel de Júpiter por Gombash et al (2014)). 1 , 2 , 3 abordagem de entrega este gene é usada em ratos eficientemente expressar qualquer proteína verde fluorescente (GFP) ou o ALS relacionados a proteína, a resposta transacional ADN-proteína obrigatória de 43 kDa (TDP-43) no SNC. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 trabalhando em ratos é significativa porque o rato está fisiológica e metabólica parâmetros estão mais próximos aos seres humanos em comparação com ratos e há ensaios toxicológicos e comportamentais projetados especificamente para ratos. Além disso, mais linhas de ratos transgénicos estão se tornando disponíveis que podem ser utilizados em estudos de transferência de gene AAV.
Métodos são detalhados para transferência de genes de CNS expansiva no rato e rápida e confiável de quantificação dos resultados. Transdução de CNS em larga escala é usada para imitar a sintomatologia de ALS em ratos expressando TDP-43 ao longo da medula espinhal. O método é cauda veia injeções do vetor de ratos adultos jovens como usado em Jackson et al TDP-43 6 , 8 , 9 depois de várias semanas, TDP-43-induzido motor défices são marcados por dois métodos: escapar de reflexo e rotarod como usado em Dayton et al e Jackson et al 5 , 6 , 7 , 9 para o vetor de controle GFP, em análise post-mortem, a área fluorescente do cerebelo é calculada como um índice de eficiência de transdução como usado em Jackson et al . 6 , 8 a análise do cerebelo tem provado para ser um índice rápido e confiável do grau de transdução CNS após a entrega do gene periférica e deve ser aplicável a uma variedade de abordagens, a tentativa de transferência de genes de periféricos-para-central.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uma variedade de rotas de entrega foram testados para vetores AAV: intraparenquimatosa, intra-cerebroventricular, intra-thecal, por via venosa, intranasal, intramuscular, etc. Cada rota pode ter vantagens específicas, bem como inconvenientes. Administração de cauda veia de AAV de ratos adultos é um método confiável para a realização de transdução consistente do SNC. O método de injeção periférica evita a introdução de uma cânula de injeção nos tecidos CNS e, portanto, minimamente invasivo. A expressão…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela ALS Association, Karyopharm Therapeutics, Inc., Meira GTx e uma doação de caridade para a investigação de ALS de Thomas Lawson, para os quais somos gratos. Agradecemos a eliane pomar e Donna Burney para aconselhamento e formação. JAS foi apoiada pela Fundação mentiu e National Institutes of Health conceder GM103418.
Materials
| Scale | Pelouze | SP5 | |
| Nalgene bucket | Thermo Scientific | 12014000 | 4000 mL |
| Microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Lactated Ringer's Solution | Baxter Healthcare | 0338-0114-04 | |
| Mini vortexer | Fisher Scientific | 128101 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 22624415 | |
| Laboratory film | Bemis | PM996 | |
| 1-mL syringe | BD | 309626 | Comes with a 25g needle attached. Replace with 27-30g needle for injection |
| 30g needle | BD | 305106 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | Isoflurane USP 250 mL |
| Anesthesia mask | Kopf Instruments | 906 | |
| Gauze | Henry Schein | 100-2524 | 2" x 2" (5cm x 5cm) |
| Pipet tips | USA Scientific | 1111-0816 | |
| Micropipet | Gilson | 4642080 | |
| Gas anesthesia vaporizer | SurgiVet | 4214322 | Classic T3 |
| Gas anesthesia scavenger | SurgiVet | 32373B10 | Enviro-PURE |
| Heating pad | Sears | 17280 | |
| Bench pad | VWR | 56617-006 | |
| Rotarod | Panlab/Harvard Apparatus | 76-0772 | 4 rats/ 4 mice |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2401 | 140 proof |
| 70% Isopropanol | VWR | 89108-160 | |
| Scion Image | Scion Corporation | ||
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Invitrogen | A11122 | Primary Antibody – 1:500 dilution |
| AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11070 | Secondary Antibody – 1:300 dilution |
| Axioskop 40 microscope | Zeiss |
References
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