Methoden und Tipps für die intravenöse Gabe von Adeno-assoziierten Virus an Ratten und Bewertung des zentralen Nervensystems Transduktion
Summary
Methoden für eine breit angelegte zentrale Nervensystem gen Lieferung bei der Ratte sind abgedeckt. In diesem Beispiel ist der Zweck, eine Krankheit zu imitieren, die das gesamte Rückenmark betrifft. Die weit verbreitete Transduktion lässt sich ein therapeutisches Protein aus einer einmaligen, periphere Verwaltung an die CNS liefern.
Abstract
Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren sind eine wichtige Reagenz in den Neurowissenschaften für gruppierte regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR), Optogenetik, Cre Lox targeting usw.. Dieses Manuskript soll die Ermittler versuchen expansive zentrale Nervensystem (ZNS) Gentransfer bei der Ratte über Heck Vene Injektion von AAV zu unterstützen. Breit angelegte Ausdruck ist relevant für Bedingungen mit weit verbreiteten Pathologie und einem Rattenmodell ist bedeutend wegen seiner größeren Größe und physiologischen Ähnlichkeiten mit Menschen im Vergleich zu Mäusen. In dieser Beispielanwendung wird eine breit angelegte neuronale Transduktion verwendet, um eine Neurodegenerative Erkrankung zu imitieren, die betrifft das gesamte Rückenmark Amyotrophe Lateralsklerose (ALS). Die effiziente breit angelegte CNS Transduktion einsetzbar auch therapeutische Protein Faktoren in präklinischen Studien zu liefern. Nach einem Intervall von mehreren Wochen nach der Injektion Ausdruck sind die Auswirkungen der Transduktion bewertet. Für ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) Steuerung Vektor wird der Betrag der GLP im Kleinhirn durch ein basic imaging-Programm schnell und zuverlässig geschätzt. Für motor Krankheit Phänotypen, die durch die ALS induziert werden im Zusammenhang mit Protein transactive Antwort DNA-bindendes Protein von 43 kDa (TDP-43), sind die Defizite von Flucht-Reflex und Rotarod erzielte. Über Krankheit Modellierung und Gentherapie gibt es vielfältige Anwendungsmöglichkeiten für das breit angelegte gen Zielen hier beschrieben. Die erweiterte Nutzung dieser Methode hilft bei der Beschleunigung in den Neurowissenschaften und Neurogenetik Hypothesentests.
Introduction
Rekombinantes Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren sind unverzichtbare Werkzeuge für die CNS-Forschung, weil sie für transducing Neuronen in-vivo so effizient sind. AAV-Vektoren sind sehr vielseitig für verschiedene transgene und Protein-Isoformen, verschiedenen Geweben, verschiedenen Wirtsarten und verschiedenen Darreichungsformen zu studieren. Zum Beispiel kann AAV verabreicht werden mit Mäusen ein Peripheriegerät, relativ nichtinvasiv, intravenöser Injektion, Neuronen im gesamten ZNS als erstes transduzieren Foust Et Al. und Duque Et Al. beschrieben (siehe Jupiter Papier von Gombash Et Al. (2014)). 1 , 2 , 3 dieser gen Lieferung Ansatz wird verwendet bei Ratten entweder grünes fluoreszierendes Protein (GFP) effizient zum Ausdruck bringen oder die ALS im Zusammenhang mit Protein, transactive Antwort DNA-bindendes Protein von 43 kDa (TDP-43) im ZNS. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 arbeiten bei Ratten ist bedeutsam, weil die Ratte physiologische und metabolische Parameter für den Menschen im Vergleich zu Mäusen näher sind und es Verhaltens- und toxikologische Tests, die speziell für die Ratten gibt. Weiterhin mehr transgene Ratte Linien sind immer verfügbar, die in AAV gen Übertragung Studien genutzt werden.
Methoden sind für expansive CNS Gentransfer in die Ratte und schnelle, zuverlässige Quantifizierung der Ergebnisse detailliert. Breit angelegte CNS Transduktion wird verwendet, um die Symptomatik Alsen in Ratten zu imitieren, TDP-43 in das Rückenmark zum Ausdruck zu bringen. Die Methode ist Tail Vene Injektionen von TDP-43 Vektor zu jungen Erwachsenen Ratten wie in Jackson Et al. 6 , 8 , 9 nach mehreren Wochen, TDP-43-induzierte motorische Defizite werden erzielt durch zwei Methoden: entkommen, Reflex und Rotarod wie in Dayton Et Al. und Jackson Et Al. 5 , 6 , 7 , 9 für Kontrolle GFP Vektor, in Post-Mortem-Analyse ist die fluoreszierende Fläche des Kleinhirns als Index der Transduktion Effizienz wie bei Jackson Et Al. berechnet 6 , 8 die Analyse des Kleinhirns erweist sich eine schnelle und zuverlässige Index für den Grad der CNS Transduktion nach peripheren gen Lieferung und auf eine Vielzahl von Ansätzen versucht peripher-zentrale Gentransfer anwendbar sein sollte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine Vielzahl von Touren für AAV-Vektoren wurden getestet: Intra-Parenchym, Intra-Cerebroventricular, Intra-thecal, intravenöse, intranasale, intramuskulären, etc.. Jede Route kann sowohl vor-als auch Nachteile haben. Heckrotorblätter Vene Verabreichung von AAV an erwachsenen Ratten ist eine zuverlässige Methode zur Erreichung konsistente Transduktion des ZNS. Die peripheren Injektionsverfahren vermeidet die Einführung einer Injektionskanüle in der CNS-Gewebe und ist daher minimal invasiv. Die effiziente CNS-Ausdr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der ALS Association, Karyopharm Therapeutics, Inc., Meira GTx und einer Spende für ALS-Forschung von Thomas Lawson, wofür wir dankbar sind finanziert. Wir danken Elysse Obstgarten und Donna Burney für Beratung und Schulung. JAS wurde unterstützt von der Stiftung gelogen und National Institutes of Health gewähren GM103418.
Materials
| Scale | Pelouze | SP5 | |
| Nalgene bucket | Thermo Scientific | 12014000 | 4000 mL |
| Microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Lactated Ringer's Solution | Baxter Healthcare | 0338-0114-04 | |
| Mini vortexer | Fisher Scientific | 128101 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 22624415 | |
| Laboratory film | Bemis | PM996 | |
| 1-mL syringe | BD | 309626 | Comes with a 25g needle attached. Replace with 27-30g needle for injection |
| 30g needle | BD | 305106 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | Isoflurane USP 250 mL |
| Anesthesia mask | Kopf Instruments | 906 | |
| Gauze | Henry Schein | 100-2524 | 2" x 2" (5cm x 5cm) |
| Pipet tips | USA Scientific | 1111-0816 | |
| Micropipet | Gilson | 4642080 | |
| Gas anesthesia vaporizer | SurgiVet | 4214322 | Classic T3 |
| Gas anesthesia scavenger | SurgiVet | 32373B10 | Enviro-PURE |
| Heating pad | Sears | 17280 | |
| Bench pad | VWR | 56617-006 | |
| Rotarod | Panlab/Harvard Apparatus | 76-0772 | 4 rats/ 4 mice |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2401 | 140 proof |
| 70% Isopropanol | VWR | 89108-160 | |
| Scion Image | Scion Corporation | ||
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Invitrogen | A11122 | Primary Antibody – 1:500 dilution |
| AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11070 | Secondary Antibody – 1:300 dilution |
| Axioskop 40 microscope | Zeiss |
References
- Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
- Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. Intravenous injections in neonatal mice. J. Vis. Exp. (93), e52037 (2014).
- Wang, D., et al. Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed. Mol. Ther. 18 (12), 2064-2074 (2010).
- Dayton, R., et al. Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis. Mol. Ther. 21 (7), 1324-1334 (2013).
- Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036 (2015).
- Jackson, K., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).
- Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B. Front. Mol. Neurosci. 9, 116 (2016).
- Jackson, K., et al. Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats. BMC Neuroscience. 17 (1), 69 (2016).
- Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).
- Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. Gene vector "magic bullet": targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter. Expert Opin Ther Targets. 20 (10), 1153-1154 (2016).
- van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. Gas embolism: pathophysiology and treatment. Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23 (5), 237-246 (2003).
