Summary

طرق ونصائح للإدارة عن طريق الحقن الوريدي من الفيروسات المرتبطة بالغدد للفئران والتقييم لتوصيل الجهاز العصبي المركزي

Published: August 25, 2017
doi:

Summary

وتغطي الطرق لتسليم الجهاز العصبي المركزي على نطاق واسع جينات في الفئران. في هذا المثال، الغرض هو تقليد مرض الذي يؤثر على كامل الحبل الشوكي. يمكن استخدام تنبيغ على نطاق واسع لتقديم بروتين علاجي للجهاز العصبي المركزي من إدارة مرة واحدة، والأجهزة الطرفية.

Abstract

نواقل الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) كاشف رئيسية في علوم الأعصاب متفاوت يكرر المتناوب القصير إينتيرسباسيد بانتظام (كريسبر)، أوبتوجينيتيكس، واستهداف لوكس cre، إلخ. والغرض من هذه المخطوطة مساعدة المحقق محاولة توسعية الجهاز العصبي المركزي (CNS) نقل الجينات في الفئران عن طريق حقن الوريد الذيل من إف. التعبير على نطاق واسع ذات الصلة للشروط مع علم الأمراض على نطاق واسع، ونموذج فأر كبير نظراً لحجم أكبر وأوجه التشابه الفسيولوجي للبشر مقارنة بالفئران. في تطبيق هذا المثال، يستخدم توصيل الخلايا العصبية على نطاق واسع لتقليد مرض الأعصاب يؤثر على كامل الحبل الشوكي، التصلب العضلي الجانبي (المرض). يمكن أيضا استخدام توصيل الجهاز العصبي المركزي على نطاق واسع كفاءة إيصال العوامل العلاجية البروتين في الدراسات ما قبل السريرية. بعد فاصل تعبير بعد حقن لعدة أسابيع، يتم تقييم الآثار المترتبة توصيل. لناقل تحكم البروتينات فلورية خضراء (التجارة والنقل)، تقدر كمية بروتينات فلورية خضراء في المخيخ بسرعة وبشكل موثوق بها برنامج تصوير أساسية. تعمل المرض الحركية التي هي الناجمة عن المرض ذات الصلة استجابة ترانساكتيفي البروتين البروتين الحمض النووي ملزم من كاتشين 43 (ماساتشوستس-43)، وسجل العجز منعكس الهروب وروتارود. أبعد من النمذجة المرض والعلاج الجيني، هناك مختلف التطبيقات المحتملة لاستهداف الجينات على نطاق واسع وصفها هنا. التوسع في استخدام هذا الأسلوب سوف تساعد في التعجيل بفرضية اختبار في علوم الأعصاب ونيوروجينيتيكس.

Introduction

الناقلة المؤتلف الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) أدوات لا غنى عنها للجهاز العصبي المركزي للبحث نظراً لأنها تتسم بالكفاءة حتى ترانسدوسينج الحية في الخلايا العصبية. إف الناقلة مرنة جداً لدراسة المتسلسلات مختلفة و isoforms البروتين والأنسجة المختلفة والمضيف مختلفة الأنواع وطرق مختلفة للإدارة. على سبيل المثال، يمكن أن تدار إف للفئران بأحد الأجهزة الطرفية، نسبيا غير الغازية، الحقن الوريدي ترانسدوسي الخلايا العصبية في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي صيغته الأولى الموصوفة في فوست et al. ودوكي et al. (انظر ورقة جوف من جومباش et al. (2014)). 1 , 2 , 3 يستخدم هذا النهج إيصال الجينات في الفئران للتعبير عن كفاءة أما البروتينات الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء) أو المتصلة المرض بالبروتين، استجابة ترانساكتيفي البروتين الحمض النووي ملزم من كاتشين 43 (ماساتشوستس-43) في الجهاز العصبي المركزي. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 العامل في الفئران هام للمعلمات الفسيولوجية والأيضية للفئران أقرب إلى البشر بالمقارنة مع الفئران وهناك فحوصات السلوكية والسمية التي صممت خصيصا للفئران. وعلاوة على ذلك، أصبحت أكثر من خطوط الفئران المعدلة وراثيا المتوفرة التي يمكن استخدامها في الدراسات نقل الجينات إف.

وترد تفاصيل أساليب لنقل الجينات CNS توسعية في الفئران، وتقدير النتائج سريعة وموثوق بها. توصيل الجهاز العصبي المركزي على نطاق واسع يستخدم لتقليد الأعراض للمرض في الفئران بالإعراب عن ماساتشوستس-43 في الحبل الشوكي. الأسلوب حقن الوريد ذيل ناقل ماساتشوستس-43 الفئران البالغين الشباب كالمستخدمة في جاكسون et al. 6 , 8 , 9 وبعد عدة أسابيع، هي سجل العجز الحركي الناجم عن ماساتشوستس-43 بطريقتين: الهروب العاكسة وروتارود كما استخدمت في دايتون وآخرون وجاكسون et al. 5 , 6 , 7 , 9 الذي يحسب لناقل بروتينات فلورية خضراء السيطرة، في تحليل الجثة، منطقة المخيخ فلوري كمؤشر لكفاءة توصيل المستخدمة في جاكسون et al. 6 , 8 تحليل المخيخ ثبت أن مؤشر سريع وموثوق بها لدرجة توصيل الجهاز العصبي المركزي بعد تسليم الجينات المحيطية، وينبغي أن تنطبق على مجموعة متنوعة من النهج محاولة نقل الجينات الطرفية للوسطي.

Protocol

جميع الإجراءات اتبعت المبادئ التوجيهية الملائمة للمعاهد الوطنية للصحة. كافة الإجراءات المتبعة البروتوكولات الحيوانية التي أقرتها لجنة الاستخدام في مركز العلوم الصحية خدمات المتعلمين في شريفبورت ورعاية الحيوان. واستخدمت هذا الإجراء إناث الفئران سبراغ داولي في 6 أسابيع عمر- <p class="jove_tit…

Representative Results

ينبغي أن تنشأ العاهات، ماساتشوستس-43 موتور المستحثة خلال 2-6 أسابيع حسب جرعة ماساتشوستس إف-43 المستخدمة (الشكل 1). سيؤدي إلى حقن الوريد الذيل غير ناجحة في جزئية أو لا العاهات؛ إف يجب أن تصل إلى مجرى الدم تنتج الأثر. سيؤدي إلى حقنه ناجح للتجارة والنقل إف في التع?…

Discussion

تم اختبار مجموعة متنوعة من طرق التسليم لناقلات إف: داخل متني، داخل-سيريبروفينتريكولار، داخل thecal، عن طريق الحقن الوريدي، داخل الآنف، وداخل العضلات، إلخ. قد يكون كل مسار مزايا محددة، فضلا عن العيوب. إدارة السياق ذيل إف للفئران الكبار وسيلة يمكن الاعتماد عليها لتحقيق توصيل متسقة من الجهاز ا?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل المرض المداواة كاريوفارم، رابطة، وجهازا ميرا وهبة خيرية لأبحاث المرض من لوسون توماس، ونحن ممتنون. ونحن نشكر بستان اليسي ودونا بورني للمشورة والتدريب. جاس تدعمها “المؤسسة كذب” و “المعاهد الوطنية للصحة” منح GM103418.

Materials

Scale Pelouze SP5
Nalgene bucket Thermo Scientific 12014000 4000 mL
Microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Lactated Ringer's Solution Baxter Healthcare 0338-0114-04
Mini vortexer Fisher Scientific 128101
Centrifuge Eppendorf 22624415
Laboratory film Bemis PM996
1-mL syringe BD 309626 Comes with a 25g needle attached.
Replace with 27-30g needle for injection
30g needle BD 305106
Isoflurane Piramal Healthcare 66794-013-25 Isoflurane USP 250 mL
Anesthesia mask Kopf Instruments 906
Gauze Henry Schein 100-2524 2" x 2" (5cm x 5cm)
Pipet tips USA Scientific 1111-0816
Micropipet Gilson 4642080
Gas anesthesia vaporizer SurgiVet 4214322 Classic T3
Gas anesthesia scavenger SurgiVet 32373B10 Enviro-PURE
Heating pad Sears 17280
Bench pad VWR 56617-006
Rotarod Panlab/Harvard Apparatus 76-0772 4 rats/ 4 mice
70% Ethanol Decon Laboratories, Inc. 2401 140 proof
70% Isopropanol VWR 89108-160
Scion Image Scion Corporation
GFP Tag Polyclonal Antibody Invitrogen A11122 Primary Antibody – 1:500 dilution
AlexaFluor 488 Invitrogen A11070 Secondary Antibody – 1:300 dilution
Axioskop 40 microscope Zeiss

References

  1. Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
  2. Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
  3. Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. Intravenous injections in neonatal mice. J. Vis. Exp. (93), e52037 (2014).
  4. Wang, D., et al. Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed. Mol. Ther. 18 (12), 2064-2074 (2010).
  5. Dayton, R., et al. Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis. Mol. Ther. 21 (7), 1324-1334 (2013).
  6. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036 (2015).
  7. Jackson, K., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).
  8. Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B. Front. Mol. Neurosci. 9, 116 (2016).
  9. Jackson, K., et al. Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats. BMC Neuroscience. 17 (1), 69 (2016).
  10. Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).
  11. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. Gene vector "magic bullet": targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter. Expert Opin Ther Targets. 20 (10), 1153-1154 (2016).
  12. van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. Gas embolism: pathophysiology and treatment. Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23 (5), 237-246 (2003).

Play Video

Cite This Article
Grames, M. S., Jackson, K. L., Dayton, R. D., Stanford, J. A., Klein, R. L. Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction. J. Vis. Exp. (126), e55994, doi:10.3791/55994 (2017).

View Video