Summary

Venez sur le côté de la lumière: In Vivo surveillance des Infections à Pseudomonas aeruginosa Biofilm dans les plaies chroniques dans un modèle murin glabres diabétique

Published: October 10, 2017
doi:

Summary

Nous décrivons ici un nouveau modèle murin diabétique utilisant des souris sans poils pour en temps réel, non invasif, surveillance des infections de plaies du biofilm de bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. Cette méthode peut être adaptée pour évaluer l’infection d’autres espèces de bactéries et micro-organismes génétiquement modifiés, y compris les biofilms multi-espèces et tester l’efficacité des stratégies antibiofilm.

Abstract

La présence de bactéries comme les biofilms structurés dans les plaies chroniques, surtout chez les patients diabétiques, est censée empêcher la cicatrisation des plaies et la résolution. Murin de plaies chroniques ont été utilisés pour comprendre les interactions sous-jacentes entre les micro-organismes et l’hôte. Les modèles développés à ce jour s’appuient sur l’utilisation des animaux à poil et collection terminale d’un tissu pour la détermination des bactéries viables. Bien que la perspicacité significative a été acquise avec ces modèles, cette procédure expérimentale nécessite un grand nombre d’animaux et échantillonnage prend du temps. Nous avons développé un nouveau modèle murin qui intègre plusieurs innovations optimales afin d’évaluer la progression du biofilm dans les plaies chroniques : une) qu’il utilise des souris sans poils, éliminant le besoin pour l’épilation ; b) s’applique pré-formé biofilms sur les blessures permettant l’évaluation immédiate de la persistance et l’effet de ces communautés sur hôte ; c) surveille la progression du biofilm en quantifiant la production de lumière par une souche génétiquement modifiée bioluminescente Pseudomonas aeruginosa, ce qui permet une surveillance en temps réel de l’infection, réduisant ainsi le nombre d’animaux requis par l’étude. Dans ce modèle, une plaie pleine profondeur unique est produite sur le dos des souris sans poils diabétiques par STZ et inoculée avec des biofilms de la souche de P. aeruginosa bioluminescente Xen 41. Rendement lumineux de la blessure est enregistré chaque jour dans in vivo système d’imagerie, permettant une visualisation rapide de biofilm in vivo et in situ et la localisation des biofilms bactéries dans les plaies. Cette nouvelle méthode est souple car elle permet d’étudier d’autres micro-organismes, y compris les espèces génétiquement modifiées et des biofilms multi-espèces et peut être d’une valeur spéciale dans l’essai de stratégies anti-biofilm, y compris les antimicrobiens pansements occlusifs.

Introduction

Les biofilms sont des communautés complexes de micro-organismes noyées dans une matrice de substances polymériques qui ont été soulignées comme un facteur qui contribue à la faible résolution des plaies chroniques1. L’étude de ces populations microbiennes hautement organisées et persistantes est particulièrement important pour les patients diabétiques où mauvaise circulation dans les membres et l’altération des mécanismes sensoriels périphériques conduire à des lésions non détecté2. Aux États-Unis, on estime que 15 % des patients diabétiques se développera au moins un ulcère au cours de leur vie. Cela se traduit par une dépense économique d’environ 28 milliards dollars en traitement3,4, sans oublier le fardeau émotionnel et social rafraîchit. Comprendre les facteurs qui permettent à des communautés microbiennes à persister dans le lit de la plaie et l’impact de ces biofilms dans les événements de guérison est impératif pour conduire les meilleurs soins pour les patients atteints et propulser le développement de nouvelles approches de traitement. Par conséquent, la mise en place de traduisible et reproductible le in vivo modèles pour explorer les interactions bactériennes-hôtes est primordiale.

Modèles murins ont été avec succès développés pour étudier l’impact des biofilms dans les plaies chroniques. Ces modèles, cependant, souvent utilisent des espèces aux cheveux et évaluer biofilm clairance de dénombrements de cellules bactériennes viables de tissus excisés d’animaux sacrifiés, ce qui les rend fastidieuse et coûteuse.

Une alternative de biophotonique à l’échantillonnage de point de terminaison des animaux dans l’évaluation de l’infection a été proposée par Contag et al. (1995) 5 , qui a développé une méthode pour capturer la luminescence de constitutivement bioluminescentes Salmonella typhimurium pour mesurer l’efficacité du traitement antibiotique. D’autres études en profitant des bactéries émettrices de bioluminescence suivi. Par exemple, Rochetta et al. (2001) 6 valider un modèle d’infection afin d’étudier les infections de cuisse Escherichia coli chez des souris en mesurant la luminescence à l’aide d’un dispositif de couplage charge intensifié et plus tard, Kandolo et al. (2003) 7 a profité du photon émettant des propriétés d’une souche Staphylococcus aureus d’enquêter sur l’efficacité de plusieurs antibiotiques dans un modèle de plaie cathéter chez la souris modifiée.

La méthode caractérisée ici présente un protocole simple pour induire le diabète chez des souris sans poils, produire et ensemencer des plaies avec pré-formé biofilms bioluminescentes de P. aeruginosa et biophotonique une surveillance de l’infection en utilisant un en vivo système d’imagerie. Il offre une directe, rapide, sur place, processus non invasif et quantitatifs d’évaluation des biofilms dans les plaies chroniques et permet en outre, pour des analyses supplémentaires telles que l’imagerie microscopique de la guérison des plaies, prélèvement de sang intermittent pour les mesures de cytokine et collection de tissus terminal pour l’histologie.

Protocol

des expérimentations animales ont été approuvées par le Comité d’utilisation de la Michigan State University et d’institutionnels animalier. 1. préparation des pansements occlusifs et les entretoises de Silicone couper le pansement occlusif transparent pour faire carrés environ 1 cm x 1 cm avec des ciseaux. Couper 10 mm cercles sur une feuille de silicone épaisseur 0,5 mm avec une biopsie punch. Centre de 10 mm une biopsie 5 mm coup de poing au milieu du cercl…

Representative Results

Dans l’élaboration de ce nouveau modèle, nous avons observé beaucoup d’avantages en utilisant glabres SKH-1 sur les souris C57BL/6J, que nous avons utilisée dans le passé. Animaux soumis à des injections de STZ normalement l’expérience perte de poids progressive avec l’apparition du diabète ; Cependant, dans la plaie expériences de guérison menée précédemment par nos laboratoires reproduisant le modèle présenté par Dunn et al. (2012) 9</…

Discussion

Nous décrivons ici un nouveau modèle de souris pour l’étude des biofilms dans les plaies chroniques diabétiques qui présente de nombreux avantages pour créer un modèle reproductible, traduisible et flexible.

La première innovation est l’utilisation de souris sans poils. Autres modèles de souris ont été développés pour étudier les diabétique chroniques de cicatrisation de10,11, mais tous se sont fondés sur l’utilis…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier l’American Diabetes Association pour soutenir ce travail (Grant # #7-13-BS-180), la facilité de soutien Michigan State University Research technologie pour fournir la formation et l’accès à l’ in vivo système d’imagerie et de la Michigan State University d’investigation histopathologie Lab pour traiter les biopsies de souris pour examen histopathologique.

Materials

Opsite Smith & Nephew Model 66000041 Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards
SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr Charles River Breeding Laboratories SKH1 Hairless mice, 8 weeks old
Streptozotocin (STZ) Sigma Aldrich S0130-1G Streptozocin powder, 1g
AccuChek glucometer Accu-Chek Roche Art No. 05046025001 ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit
Pseudomonas aeruginosa Xen 41 Perkin Elmer 119229 Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa
Polycarbonate membrane filters Sigma Aldrich P9199 Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size
Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) Sigma Aldrich D8537 PBS
Tryptic soy agar Sigma Aldrich 22091 Culture agar
Meloxicam Henry Schein Animal Health 49755 Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection
10% povidone-iodine (Betadine) Purdue Products LP 301879-OA Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case
4% paraformaldehyde Fisher Scientific AAJ61899AK Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS
Capillary glass tube Fisher Scientific 22-362-566 Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes
Silicone to make splints Invitrogen Life Technologies Corp P-18178 Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets
Tryptic soy broth Sigma Aldrich 22092 Culture broth
IVIS Spectrum Perkin Elmer 124262 In vivo imaging system
IVIS Spectrum Isolation chamber Perkin Elmer 123997 XIC-3 animal isolation chamber
HEPA filter Teleflex 28022 Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022
Biopsy punches VWR International Inc 21909-142 Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50.
Biopsy punches VWR International Inc 21909-140 Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50.
Glucose J.T.Baker 1916-01 Dextrose, Anhydrous, Powder
Citric acid Sigma Aldrich C2404-100G Citric Acid
Mastisol Eloquest Healthcare HRI 0496-0523-48 Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48
Corning 96-well black plates Fisher Scientific 07-200-567 96-well clear bottom black polysterene microplates
25 gauge 5/8 inch needle BD 305122 Regular bevel needle
Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath Branson Ultrasonics N/A Ultrasonic Cleaner

References

  1. James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair Regen. 16 (1), 37-44 (2008).
  2. Gordois, A., Scuffham, P., Shearer, A., Oglesby, A., Tobian, J. A. The health care costs of diabetic peripheral neuropathy in the US. Diabetes Care. 26 (6), 1790-1795 (2003).
  3. Reiber, G. E., McDonell, M. B., Schleyer, A. M., Fihn, S. D., Reda, D. J. A comprehensive system for quality improvement in ambulatory care: assessing the quality of diabetes care. Patient Educ Couns. 26 (1-3), 337-341 (1995).
  4. Driver, V. R., Fabbi, M., Lavery, L. A., Gibbons, G. The costs of diabetic foot: The economic case for the limb salvage team. J Vasc Surg. 52 (Suppl 3), 17S-22S (2010).
  5. Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
  6. Rocchetta, H. L., et al. Validation of a noninvasive, real-time imaging technology using bioluminescent Escherichia coli in the neutropenic mouse thigh model of infection. Antimicrob Agents Chemother. 45 (1), 129-137 (2001).
  7. Kadurugamuwa, J. L., et al. Rapid direct method for monitoring antibiotics in a mouse model of bacterial biofilm infection. Antimicrob Agents Chemother. 47 (0066-4804), 3130-3137 (2003).
  8. Anderl, J. N., Franklin, M. J., Stewart, P. S. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 44 (7), 1818-1824 (2000).
  9. Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. ILAR J. 41 (2), 80-86 (2000).
  10. Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. J Vis Exp. (75), e50265 (2013).
  11. Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge – a model for the study of chronic wounds. Wound Repair Regen. 18 (5), 467-477 (2010).
  12. Holley, A. K., Xu, Y., Noel, T., Bakthavatchalu, V., Batinic-Haberle, I., St. Clair, D. K. Manganese superoxide dismutase-mediated inside-out signaling in HaCaT human keratinocytes and SKH-1 mouse skin. Antioxid Redox Signal. 20 (15), 2347-2360 (2014).
  13. Abbas, S., Alam, S., Pal, A., Kumar, M., Singh, D., Ansari, K. M. UVB exposure enhanced benzanthrone-induced inflammatory responses in SKH-1 mouse skin by activating the expression of COX-2 and iNOS through MAP kinases/NF-ĸB/AP-1 signalling pathways. Food Chem Toxicol. 96, 183-190 (2016).
  14. Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infect Immun. 82 (1), 92-100 (2014).

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Cite This Article
Hunt, A. M. A., Gibson, J. A., Larrivee, C. L., O’Reilly, S., Navitskaya, S., Busik, J. V., Waters, C. M. Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model. J. Vis. Exp. (128), e55991, doi:10.3791/55991 (2017).

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