Venez sur le côté de la lumière: In Vivo surveillance des Infections à Pseudomonas aeruginosa Biofilm dans les plaies chroniques dans un modèle murin glabres diabétique
Summary
Nous décrivons ici un nouveau modèle murin diabétique utilisant des souris sans poils pour en temps réel, non invasif, surveillance des infections de plaies du biofilm de bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. Cette méthode peut être adaptée pour évaluer l’infection d’autres espèces de bactéries et micro-organismes génétiquement modifiés, y compris les biofilms multi-espèces et tester l’efficacité des stratégies antibiofilm.
Abstract
La présence de bactéries comme les biofilms structurés dans les plaies chroniques, surtout chez les patients diabétiques, est censée empêcher la cicatrisation des plaies et la résolution. Murin de plaies chroniques ont été utilisés pour comprendre les interactions sous-jacentes entre les micro-organismes et l’hôte. Les modèles développés à ce jour s’appuient sur l’utilisation des animaux à poil et collection terminale d’un tissu pour la détermination des bactéries viables. Bien que la perspicacité significative a été acquise avec ces modèles, cette procédure expérimentale nécessite un grand nombre d’animaux et échantillonnage prend du temps. Nous avons développé un nouveau modèle murin qui intègre plusieurs innovations optimales afin d’évaluer la progression du biofilm dans les plaies chroniques : une) qu’il utilise des souris sans poils, éliminant le besoin pour l’épilation ; b) s’applique pré-formé biofilms sur les blessures permettant l’évaluation immédiate de la persistance et l’effet de ces communautés sur hôte ; c) surveille la progression du biofilm en quantifiant la production de lumière par une souche génétiquement modifiée bioluminescente Pseudomonas aeruginosa, ce qui permet une surveillance en temps réel de l’infection, réduisant ainsi le nombre d’animaux requis par l’étude. Dans ce modèle, une plaie pleine profondeur unique est produite sur le dos des souris sans poils diabétiques par STZ et inoculée avec des biofilms de la souche de P. aeruginosa bioluminescente Xen 41. Rendement lumineux de la blessure est enregistré chaque jour dans in vivo système d’imagerie, permettant une visualisation rapide de biofilm in vivo et in situ et la localisation des biofilms bactéries dans les plaies. Cette nouvelle méthode est souple car elle permet d’étudier d’autres micro-organismes, y compris les espèces génétiquement modifiées et des biofilms multi-espèces et peut être d’une valeur spéciale dans l’essai de stratégies anti-biofilm, y compris les antimicrobiens pansements occlusifs.
Introduction
Les biofilms sont des communautés complexes de micro-organismes noyées dans une matrice de substances polymériques qui ont été soulignées comme un facteur qui contribue à la faible résolution des plaies chroniques1. L’étude de ces populations microbiennes hautement organisées et persistantes est particulièrement important pour les patients diabétiques où mauvaise circulation dans les membres et l’altération des mécanismes sensoriels périphériques conduire à des lésions non détecté2. Aux États-Unis, on estime que 15 % des patients diabétiques se développera au moins un ulcère au cours de leur vie. Cela se traduit par une dépense économique d’environ 28 milliards dollars en traitement3,4, sans oublier le fardeau émotionnel et social rafraîchit. Comprendre les facteurs qui permettent à des communautés microbiennes à persister dans le lit de la plaie et l’impact de ces biofilms dans les événements de guérison est impératif pour conduire les meilleurs soins pour les patients atteints et propulser le développement de nouvelles approches de traitement. Par conséquent, la mise en place de traduisible et reproductible le in vivo modèles pour explorer les interactions bactériennes-hôtes est primordiale.
Modèles murins ont été avec succès développés pour étudier l’impact des biofilms dans les plaies chroniques. Ces modèles, cependant, souvent utilisent des espèces aux cheveux et évaluer biofilm clairance de dénombrements de cellules bactériennes viables de tissus excisés d’animaux sacrifiés, ce qui les rend fastidieuse et coûteuse.
Une alternative de biophotonique à l’échantillonnage de point de terminaison des animaux dans l’évaluation de l’infection a été proposée par Contag et al. (1995) 5 , qui a développé une méthode pour capturer la luminescence de constitutivement bioluminescentes Salmonella typhimurium pour mesurer l’efficacité du traitement antibiotique. D’autres études en profitant des bactéries émettrices de bioluminescence suivi. Par exemple, Rochetta et al. (2001) 6 valider un modèle d’infection afin d’étudier les infections de cuisse Escherichia coli chez des souris en mesurant la luminescence à l’aide d’un dispositif de couplage charge intensifié et plus tard, Kandolo et al. (2003) 7 a profité du photon émettant des propriétés d’une souche Staphylococcus aureus d’enquêter sur l’efficacité de plusieurs antibiotiques dans un modèle de plaie cathéter chez la souris modifiée.
La méthode caractérisée ici présente un protocole simple pour induire le diabète chez des souris sans poils, produire et ensemencer des plaies avec pré-formé biofilms bioluminescentes de P. aeruginosa et biophotonique une surveillance de l’infection en utilisant un en vivo système d’imagerie. Il offre une directe, rapide, sur place, processus non invasif et quantitatifs d’évaluation des biofilms dans les plaies chroniques et permet en outre, pour des analyses supplémentaires telles que l’imagerie microscopique de la guérison des plaies, prélèvement de sang intermittent pour les mesures de cytokine et collection de tissus terminal pour l’histologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici un nouveau modèle de souris pour l’étude des biofilms dans les plaies chroniques diabétiques qui présente de nombreux avantages pour créer un modèle reproductible, traduisible et flexible.
La première innovation est l’utilisation de souris sans poils. Autres modèles de souris ont été développés pour étudier les diabétique chroniques de cicatrisation de10,11, mais tous se sont fondés sur l’utilis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier l’American Diabetes Association pour soutenir ce travail (Grant # #7-13-BS-180), la facilité de soutien Michigan State University Research technologie pour fournir la formation et l’accès à l’ in vivo système d’imagerie et de la Michigan State University d’investigation histopathologie Lab pour traiter les biopsies de souris pour examen histopathologique.
Materials
| Opsite | Smith & Nephew | Model 66000041 | Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards |
| SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr | Charles River Breeding Laboratories | SKH1 | Hairless mice, 8 weeks old |
| Streptozotocin (STZ) | Sigma Aldrich | S0130-1G | Streptozocin powder, 1g |
| AccuChek glucometer | Accu-Chek Roche | Art No. 05046025001 | ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit |
| Pseudomonas aeruginosa Xen 41 | Perkin Elmer | 119229 | Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa |
| Polycarbonate membrane filters | Sigma Aldrich | P9199 | Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size |
| Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D8537 | PBS |
| Tryptic soy agar | Sigma Aldrich | 22091 | Culture agar |
| Meloxicam | Henry Schein Animal Health | 49755 | Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Purdue Products LP | 301879-OA | Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | AAJ61899AK | Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS |
| Capillary glass tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes |
| Silicone to make splints | Invitrogen Life Technologies Corp | P-18178 | Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets |
| Tryptic soy broth | Sigma Aldrich | 22092 | Culture broth |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| IVIS Spectrum Isolation chamber | Perkin Elmer | 123997 | XIC-3 animal isolation chamber |
| HEPA filter | Teleflex | 28022 | Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022 |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-142 | Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50. |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-140 | Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50. |
| Glucose | J.T.Baker | 1916-01 | Dextrose, Anhydrous, Powder |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | Citric Acid |
| Mastisol | Eloquest Healthcare | HRI 0496-0523-48 | Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48 |
| Corning 96-well black plates | Fisher Scientific | 07-200-567 | 96-well clear bottom black polysterene microplates |
| 25 gauge 5/8 inch needle | BD | 305122 | Regular bevel needle |
| Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | N/A | Ultrasonic Cleaner |
References
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