UMA<em> Caenorhabditis elegans</em> Ensaio de Aversão ao Cobre Baseado em Status Nutricional

Caenorhabditis elegans tem sido usado como modelo para o estudo da neurobiologia por décadas devido à relativa facilidade na análise dos circuitos de um sistema nervoso composto de apenas 302 neurônios ¹ . Desde que o organismo dependa de responder a pistas ambientais, grande parte do sistema nervoso é dedicado a regular a integração de sinais ambientais ² . Apesar da simplicidade de seu sistema nervoso, C. elegans pode detectar e responder a diversos sinais ambientais, incluindo repelentes ³ , atrativos ⁴ , temperatura ⁵ e até mesmo umidade ⁶ . A incapacidade de integrar adequadamente os sinais do ambiente tem sido associada a uma série de distúrbios comportamentais e doenças neurodegenerativas em sistemas modelo de mamíferos ^{7- 9.} Com uma gama de modelos disponíveis de doença neural ¹⁰ em C. elegans e o desenvolvimento de telas farmacêuticas de nemátodos ¹¹ , este organismo provou ser um sistema útil para o estudo da neurobiologia. Dada a disponibilidade de um conector de nemátodos cartografado ¹ e mutações para quase todos os genes do genoma ¹² do nematóide, nossa compreensão do sistema nervoso do nematóide e, por extensão, a nossa própria, é parcialmente limitada pelo desenho de ensaios criativos apropriados.

Uma série de ensaios de quimiotaxia foram desenvolvidos ao longo dos últimos 40 anos para avaliar a resposta de nematóides a diversos estímulos aversivos ^{3 , 4 , 13 , 14 , 15} . A experimentação inicial envolveu a introdução de um estímulo ambiental agudo enquanto um único verme vagava em uma placa de ágar= "Xref"> 3 ^{, 14 , 16} . Mudanças imediatas nas respostas locomotrizas foram registradas. Por exemplo, o octanol injetável volátil pode ser aplicado a um cabelo e flutuou na frente do nariz de um nematóide para estimular o início da locomoção para trás em vermes selvagens ¹⁷ . Ensaios mais complexos também foram desenvolvidos para incorporar variáveis ​​múltiplas como meio de avaliar a escolha comportamental ¹⁸ . Uma variação deste ensaio implica o uso de uma solução de cobre para criar uma barreira da linha média aversiva ⁴ . Um atrativo, a saber, diacetil, foi colocado em um lado da barreira química com os vermes transferidos para fora da fonte de diacetilo. Worms defeituoso para as respostas de aversão ao cobre imediatamente atravessou a barreira para atingir o diacetil, enquanto que as vermes do tipo selvagem foram inicialmente repelidas pela barreira. As respostas foram marcadas quando os vermes se aproximaram pela barreira de cobreSem observações de longo prazo.

Quando os vermes são avaliados depois de sofrerem condições de fome, sua sensibilidade aos estímulos ambientais diminui ¹⁹ . Quando o octanol químico aversivo é conduzido na frente do nariz dos nematóides, os organismos de tipo selvagem estimulam o movimento para trás dentro de 3 a 5 s quando em alimentos. Após estes organismos terem sido removidos dos alimentos durante 10 min, eles apresentam uma resposta tardia de 8-10 s ²⁰ . Assim, com o aumento da fome, os nemátodos exibem uma resposta aversiva diminuída aos sinais ambientais prejudiciais, uma vez que a busca de alimentos se torna mais essencial para a sobrevivência. Por outro lado, os nemátodos que exageram o receptor neuropéptido 9 ( npr-9) , não respondem ao octanol sobre ou fora dos alimentos e apresentam incapacidade de responder a uma série de estímulos aversivos ²¹ . Esses organismos npr-9 (GF) também não modulam sua freqüência de reversão na presença de alimentos, mas podemInverter em resposta a estímulos tácteis agressivos, indicando que eles são capazes de locomoção para trás ²¹ . Nós também avaliamos os mutantes npr-9 (LF), dado que eles exibem uma freqüência de reversão anormalmente diminuída dos alimentos, mas podem modular seu comportamento na presença de alimentos ²¹ . O acasalamento do estado nutricional do sem-fim com a introdução de estímulos externos agudos ajudou a elucidar os mecanismos pelos quais uma via relacionada ao alimento pode modular amplamente as vias de sinalização sensorial ^{22 , 23} . A presença de alimentos no ambiente de nemátodos também foi usada para avaliar respostas de retirada de etanol ²⁴ . Neste experimento, os vermes foram incubados em diferentes concentrações de etanol e depois foram colocados em uma placa de ágar com um remendo de alimento conhecido como "ensaio de raça alimentar". O parto de comida foi colocado em uma borda da placa enquanto os nematóides wAntes da distância da fonte de comida. A retirada de etanol foi avaliada medindo a duração do tempo necessário para que os vermes alcancem o remendo de alimentos.

Este ensaio de aversão de cobre com base em nutrientes baseia-se no ensaio da raça alimentar para integrar variáveis ​​ambientais adicionais, nomeadamente alimentos e cobre, ao mesmo tempo que avaliam as mudanças comportamentais ao longo do tempo. Esta é uma adaptação de um protocolo de uso comum em toda a comunidade C. elegans ⁴ . Este protocolo tem sido utilizado para avaliar respostas aversivas e a detecção de alimentos ao longo de um período de quatro horas ²¹ . Uma vez que os comportamentos de fome de exibição de vermes após 30 minutos de privação de alimentos ²⁵ , também podemos avaliar como as mudanças no estado nutricional podem influenciar as respostas ambientais. As condições deste ensaio medem como os organismos experimentais alteram a capacidade de resposta aos estímulos aversivos ao longo do tempo, portanto, avalia as mudanças comportamentais comoOs organismos progridem para um estado de fome (e continuam as medidas de fome prolongada). Uma vez que os animais npr-9 (GF) não alteram seu comportamento em resposta a alimentos ou muitas pistas aversivas, buscamos identificar se esses déficits comportamentais persistiriam no contexto da fome. Em última análise, este design de ensaio foi formulado para avaliar especificamente os mutantes npr-9 (GF), mas pode ser ainda adaptado para caracterizar novas variedades.