Пептидов и белков количественной оценки с использованием автоматизированных иммуно-MALDI (iMALDI)
Summary
Представлен протокол для количественного определения белка в сложных биологических жидкостей, с использованием технологии автоматизированного иммуно MALDI (iMALDI).
Abstract
Масс-спектрометрия (МС) является одним из наиболее часто используемых технологий для количественной оценки белков в сложных проб, с отличным пробирного специфичности в результате прямого обнаружения соотношение массы и заряда каждой молекулы целевых. Однако на основе MS протеомики, как большинство других аналитических методов, имеет уклон в сторону измерения высоких изобилие аналитов, так это сложно добиться обнаружения ограничивает низкой нг/мл или ПГ/мл в сложных образцов и это является диапазон концентраций для многих болезни соответствующих белков в biofluids таких как человеческой плазмы. Для оказания помощи в обнаружении низкого изобилие аналитов, иммуно обогащение интегрирована в assay сконцентрироваться и очищают аналита перед МС измерение, значительно улучшая анализа чувствительности. В этой работе технология иммуно – Matrix-Assisted лазерной десорбции/ионизации (iMALDI) представлены для количественного определения белков и пептидов в biofluids, основанные на иммуно обогащение на бусы, следуют MALDI MS измерения без предварительного Элюирование. Антитела против пептида функционализированных на магнитные бусы и инкубировали с образцами. После мытья, бисер передаются непосредственно на пластину MALDI целевой, и сигналы измеряются MALDI-время полета (MALDI-TOF) документа после того, как матрица решение было применено к бисеру. Упрощается процедура подготовки образца, по сравнению с другими иммуно MS анализов, и измерение MALDI быстро. Подготовка всей выборки автоматизирован с жидкостью системы, обработки с улучшение пробирного воспроизводимость и высокую пропускную способность. В этой статье, iMALDI assay используется для определения пептид ангиотензин I (анг я) концентрация в плазме крови, которая клинически используется как индикация активности ренина плазмы для скрининга первичный гиперальдостеронизм (PA).
Introduction
Масс-спектрометрия стала незаменимым инструментом в количественном протеомики. Масс-спектрометрия можно определить массы целевых белков и пептидов, поэтому полученные аналита сигналы могут быть весьма конкретными по сравнению с иммуноанализа. Два способа ионизации, электроспрей и MALDI, наиболее часто используются для определения белков и пептидов,1,2,3,4. Серьезной проблемой в количественной оценки на основе MS белка лежит в обнаружении низкого изобилие белков в сложных проб на нг/мл или ПГ/мл концентрация в присутствии высоких изобилие белков, и многие кандидат белковых биомаркеров в плазме крови человека в рамках этого диапазона5. Эта проблема во многом вызвано изначально широкий динамический диапазон и сложность человеческого протеома6.
Для преодоления этих проблем обнаружения, иммуно MS методы были разработаны для обогащения белков-мишеней или пептиды из примеров решений на прочную поверхность, следуют элюции аналитов и МС измерение7,8 , 9 , 10. через иммуно обогащение, аналитов очищаются от сложных образцов и таким образом к минимуму Ион подавление эффекты от других молекул. Среди различных твердых поддерживает, магнитные шарики в настоящее время наиболее широко используются как они имеют преимущества высокой антитела связывающая способность и простотой в обращении. Магнитные бусы с различными functionalizations и размеров разработаны и коммерциализации для иммунопреципитации экспериментов. На сегодняшний день, иммуно обогащение на бусины была сопряжена с электроспрей ионизации (ESI) и MALDI MS для измерения белков и пептидов. В стабильных изотопов стандартов и захвата анти пептида антитела (SISCAPA) технологии перевариваются белки в образцах, следуют инкубации с антителами бусины иммуно-обогащения. В «классических» SISCAPA захваченные proteotypic пептидов этого eluted из бисера и измеряется по жидкой хроматографии-ESI-мс (LC-MS), или путем прямого инфузии ESI-несколько реакции мониторинг-мс (ESI-мно-МС)11,12. Иммуно обогащение улучшена чувствительность пробирного управления записями сообщений по 3-4 порядка величины, достигнув диапазон низких нг/мл13.
По сравнению с электроспрей MS, MALDI MS быстрее и не включают очистки и восстановления сбалансированности LC столбцов так Есть никаких проблем загрязнения и уноса, что делает его более подходящим для высок объём исследований14. Иммуно-MALDI технология была разработана в нашей лаборатории объединить иммуно обогащения с MALDI MS для чувствительной и конкретной количественной оценки пептидов и белков (основанный на количественный proteotypic пептидов)15,16 ,17. После иммуно обогащение бисер залегают на плите целевой MALDI, матрица решение добавляется к бисеру и плита готова для анализа MALDI-TOF MS после высыхания. Элюирующий пептидов из бисера не выполняется как отдельный шаг, но сходство прыгните аналитов этого eluted путем решения матрицы MALDI когда он добавляется к шарик пятна, таким образом упрощая пробоподготовки и минимизации потерь образца. IMALDI технология применялась в различных приложениях18,19и недавно автоматизированных и используется для измерения ангиотензин I (анг я) для определения плазмы ренина активность (PRA)20. Этот протокол будет демонстрировать процедура, используемая для выполнения автоматизированных iMALDI assay. Принимая PRA assay как, например, CVs между день менее 10% были достигнуты благодаря автоматизации, с возможностью измерения 744 проб в день20.
Assay пра iMALDI, продемонстрировали в этой рукописи не требует переваривания белка, как молекулы целевых (анг я) – это пептид с молекулярной массой 1295.7 да. В других анализов, где необходима переваривания белка и пептид используется как суррогат для интактных белков выбранный пептидные для iMALDI должны быть уникальными и специфическими для целевого белка, с массой более 800 да так что она может быть легко отличить от c химический шум от решения матрицы MALDI. Анти пептида антитела необходимы для иммуно обогащение пептидов. Протокол для измерения пра iMALDI assay состоит из четырех этапов: 1) поколение Анг I в плазме крови человека; 2) иммуно обогащение анг я использую бисер антителами; 3) передача Бусы MALDI целевой пластины и Добавление матрицы решения; и 4) сигнал приобретение MALDI-TOF-MS и данных анализа20.
Protocol
Representative Results
Discussion
По сравнению с обычными белка на основе MS количественной оценки, iMALDI использует антитела, чтобы обогатить аналитов и очистить их от сложных образцов, поэтому делает возможным количественно белков и пептидов при низких концентрациях. Важнейшим шагом в iMALDI протоколе является иммуно обо?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим финансовой поддержки из генома Канады и Британской Колумбии генома для операций (204PRO) и развития технологии (214PRO) через сеть инноваций генома (Джин). Мы благодарим платформы обнаружения наркотиков в исследовательском институте центра здоровья университета МакГилл для использования MALDI-TOF инструмента для съемок. H.L. благодарен за поддержку от докторантура стипендий от национальной науки и инженерных исследований Совет Канады (СЕНТИ). C.H.B благодарен за поддержку от переднего края Дотационный фонд (LEEF). C.H.B. благодарен за поддержку Председателя McGill Сигал в молекулярная онкология в университете Макгилла (Монреаль, Квебек, Канада). M.X.C. и C.H.B. благодарна за поддержку от Уоррен ю. Сопер благотворительный фонд и Фонд семьи Сегал Элвин еврейской больницы (Монреаль, Квебек, Канада).
Materials
| Healthy control human plasma | Bioreclamation | HMPLEDTA2 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Ammonium citrate dibasic | Sigma Aldrich | 09833 | |
| CHAPS (>=98%) | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Albumin from chicken egg white (>98%) | Sigma Aldrich | A5503 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | EDS | |
| Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma Aldrich | 78830 | |
| Trifluoroacetic acid | Thermo Fisher Scientific | 85172 | LC-MS grade |
| acetonitrile | Fluka | 34967 | LC-MS grade |
| water | Fluka | 39253 | LC-MS grade |
| acetic acid | Fluka | 320099 | LC-MS grade |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Roche Diagnostics | 3118169001 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 10003D | 2.8 μm, 30 mg/mL |
| anti-Ang I goat polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-7419 | |
| Nat and SIS Ang I | synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre | ||
| Automated liquid handling system | Agilent | 16050-102 | Agilent Bravo robotic workstation |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Invitrogen DynaMag-2 magnet |
| Tube rotator | Theromo Scientific | 400110Q | Labquake Tube Rotator |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | DynaMag-96 side skirted magnet |
| Magnet | VP Scientific | 771RM-1 | used to pull the beads to the bottom of the well |
| MALDI-TOF | Bruker | Bruker Microflex LRF instrument |
References
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
- Nicol, G. R., et al. Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients. Mol. & Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).
- Webster, J., Oxley, D., Zanders, E. D. . Chemical Genomics and Proteomics: Reviews and Protocols. , 227-240 (2012).
- Yergey, A. L., et al. De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13 (7), 784-791 (2002).
- Anderson, L. Six decades searching for meaning in the proteome. J. Proteomics. 107, 24-30 (2014).
- Landegren, U., et al. Opportunities for Sensitive Plasma Proteome Analysis. Anal. Chem. 84 (4), 1824-1830 (2012).
- Guo, A., et al. Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation. Mol. & Cell. Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).
- Florentinus-Mefailoski, A., Soosaipillai, A., Dufresne, J., Diamandis, E. P., Marshall, J. G. An enzyme-linked immuno-mass spectrometric assay with the substrate adenosine monophosphate. Anal. Bioanal. Chem. 407 (4), 1119-1130 (2015).
- Fredolini, C., et al. Immunocapture strategies in translational proteomics. Expert Rev Proteomics. 13 (1), 83-98 (2016).
- Tran, J. C., et al. Automated Affinity Capture and On-Tip Digestion to Accurately Quantitate in Vivo Deamidation of Therapeutic Antibodies. Anal. Chem. , (2016).
- Razavi, M., Leigh Anderson, N., Pope, M. E., Yip, R., Pearson, T. W. High precision quantification of human plasma proteins using the automated SISCAPA Immuno-MS workflow. N. Biotechnol. 33 (5 Part A), 494-502 (2016).
- Razavi, M., et al. High-Throughput SISCAPA Quantitation of Peptides from Human Plasma Digests by Ultrafast, Liquid Chromatography-Free Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 11 (12), 5642-5649 (2012).
- Anderson, N. L., et al. SISCAPA Peptide Enrichment on Magnetic Beads Using an In-line Bead Trap Device. Mol. & Cell. Proteomics. 8 (5), 995-1005 (2009).
- Parker, C. E., Pearson, T. W., Anderson, N. L., Borchers, C. H. Mass-spectrometry-based clinical proteomics – a review and prospective. The Analyst. 135 (8), 1830-1838 (2010).
- Reid, J. D., Holmes, D. T., Mason, D. R., Shah, B., Borchers, C. H. Towards the Development of an Immuno MALDI (iMALDI) Mass Spectrometry Assay for the Diagnosis of Hypertension. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21 (10), 1680-1686 (2010).
- Mason, D. R., Reid, J. D., Camenzind, A. G., Holmes, D. T., Borchers, C. H. Duplexed iMALDI for the detection of angiotensin I and angiotensin II. Methods. 56 (2), 213-222 (2012).
- Camenzind, A. G., vander Gugten, J. G., Popp, R., Holmes, D. T., Borchers, C. H. Development and evaluation of an immuno-MALDI (iMALDI) assay for angiotensin I and the diagnosis of secondary hypertension. Clin. Proteomics. 10 (1), 20 (2013).
- Jiang, J., et al. Development of an immuno tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for EGFR diagnosis. Proteomics Clin Appl. 1, (2007).
- Jiang, J., Parker, C. E., Fuller, J. R., Kawula, T. H., Borchers, C. H. An Immunoaffinity Tandem Mass Spectrometry (iMALDI) assay for Detection of Francisella tularensis. Analytica chimica acta. 605 (1), 70-79 (2007).
- Popp, R. An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI). Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1854 (6), 547-558 (2015).
- Schoenherr, R. M., et al. Automated screening of monoclonal antibodies for SISCAPA assays using a magnetic bead processor and liquid chromatography-selected reaction monitoring-mass spectrometry. J Immunol Methods. 353 (1-2), 49-61 (2010).
- Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. US patent. , (2010).
- Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. Canadian patent CA. , (2011).
- Weiß, F., et al. Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1844 (5), 927-932 (2014).
- Nelson, A. L. Antibody fragments: Hope and hype. mAbs. 2 (1), 77-83 (2010).
- Gupta, V., et al. An evaluation of an aptamer for use as an affinity reagent with MS: PCSK9 as an example protein. Bioanalysis. 8 (15), 1557-1564 (2016).
