JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

Tahlil fosforilasyon ve yerelleştirme kolorektal kanser hücrelerinin Tau proteinin birlikte Mikrotubul bağlama için

Published: October 10, 2017
doi:
10.3791/55932
, ,
1Systems Biotechnology Research Center,KIST Gangneung Institute of Natural Products, 2Division of Bio-Medical Science & Technology, KIST School,Korea University of Science and Technology

Summary

Bu el yazması tau hyperphosphorylation, tau bağlama mikrotübüller ve hücre içi tau ilaç tedavileri takip yerelleştirilmesini ölçme ölçmek için standart iletişim kurallarını açıklar. Bu protokoller sürekli uyuşturucu ya da tau hyperphosphorylation veya Mikrotubul bağlama hedef diğer bileşikler eleme için kullanılabilir.

Abstract

Mikrotubul ilişkili protein tau çoğunlukla akson yerelleştirir nöronal bir proteindir. Genellikle tau Mikrotubul derleme ve sabitleme yer çünkü normal nöronal işleyişi için gereklidir. Nöronlar yanı sıra, tau insan meme, prostat, mide, kolorektal ve nerede neredeyse benzer yapısını gösterir ve benzer işlevleri nöronal tau giderek artan pankreas kanserleri ile ifade edilir. Tau ve onun fosforilasyon miktarı onun işlevini mikrotübüller sabitleyici değiştirin ve Alzheimer hastalığı gibi farklı nörodejeneratif hastalıklarda eşleştirilmiş Helisel filamentler gelişmesine yol. Tau ve Mikrotubul bağlama özellikleri fosforilasyon durumunu belirlemek önemlidir. Buna ek olarak, tau hücre içi lokalizasyonu inceleyerek farklı hastalıklarda önemlidir. Tau fosforilasyon ve mikrotübüller kolorektal kanser hücreleri veya curcumin ve LiCl tedavi olmadan içinde tau bağlama ölçmek için bu el yazması detayları standart iletişim kuralları. Bu tedaviler kanser hücre çoğalması ve geliştirme durdurmak için kullanılabilir. Hücre içi tau yerelleştirilmesini immünhistokimya ve confocal mikroskobu antikorlar düşük miktarda kullanırken kullanarak incelenir. Bu deneyleri hkr tau hyperphosphorylation veya Mikrotubul bağlama etkileyen bileşikler eleme için kullanılabilir. Roman therapeutics için farklı tauopathies kullanılan veya bu iletişim kurallarını kullanarak ilgili antikanser ajanların potansiyel olarak karakterize edilebilir.

Introduction

Tau aslında tübülin1ile birlikte saf bir ısı-kararlı Mikrotubul ilişkili protein olarak tespit edilmiştir. Tau sadece daha yüksek Ökaryotlar2,3,4‘ te ifade edilir. Tau ana fonksiyonu Mikrotubul derleme1,5,6kontrol etmektir. Ayrıca mikrotübüller7, aksonal transport8, aksonlar çapı9değişimler, nöroma polarite ve ateş10polimerizasyon için katkıda bulunur. Tau da bazı sinyal yolları kontrol etmek için bir protein iskele davranır. Sıçan beyin çalışmalar önermek o tau nöron özel ve akson11‘ öncelikle yerelleştirir. Tau Mikrotubul polimerizasyon ve nöronal gelişim için gerekli olduğundan, tau merkezi sinir sistemi aksonal gelişiminde önemli bir rol oynamaya onaylanmadığına karar; Bu hipotez sonraki vitro ve in vivo deneyler tarafından doğrulanmadı. Nöronlar yanı sıra, karaciğer, böbrek ve kas hücreleri12,13de dahil olmak üzere farklı nöronal olmayan hücrelerde, tau ifade edilir. Tau da insan meme, prostat, kolorektal, mide ve pankreas kanseri hücre satırları ve dokular14,15,16,17,18, ifade edilir 19. tau da dahil organları20bükülmüş tubulofilaments olarak dahil-vücut miyozit içinde bulundu.

Tau birkaç translasyonel modifikasyonlar taşıyabilir. Tüm translasyonel modifikasyonlar fosforilasyon yaygın olarak kullanılır. Artan tau fosforilasyon mikrotübüller, nihayet sitoiskeleti istikrarsızlaştırıcı için onun ilgi azalır. Seksen beş fosforilasyon siteleri insan Alzheimer hastalığı beyin dokulardan izole tau protein tarif edilmistir. Bu siteleri, serin, % 41 treonin ve sadece % 6 tirozin kalıntıları21,22,%2353 teşkil etmektedir. Tau fosforilasyon onun yerelleştirme, fonksiyon, bağlama, çözünürlük ve diğer translasyonel modifikasyonlar, duyarlılık etkiler. Ayrıca tau fosforilasyon normal ölçüde daha (veya fosfat grupları ile tam doygun) Alzheimer hastalığı24yapısal ve işlevsel özellikleri çoğaltır hyperphosphorylation bilinir. Tau aksonal mikrotübüller düzgün tutar ve normal nöronal fizyolojik koşullar altında çalışmasını sağlar. Ancak, hyperphosphorylated tau Mikrotubul sökme nedeniyle nöronal kaybına neden bir iyi organize edilmiş Mikrotubul bağlama korumak başarısız olur. Tau fosforilasyon normal düzeyde uygun tau işleyişi için gereklidir, ancak tau karakteristik fosforilasyon seviyesine bir değişiklik yapıldığında ve hyperphosphorylated25ise normal işlevine başarısız olur. Alzheimer hastalığı ve bazı diğer yaşa bağlı nörodejeneratif hastalıklar, tau hyperphosphorylated olur ve eşleştirilmiş Helisel filamentler ve neurofibrillary tangles26,27oluşturur. Böylece, tau fosforilasyon ve Mikrotubul bağlama belirlemek için önemli yöntemlerdir.

Kolorektal kanser, bir yaşlanma ilişkili kanser üçüncü en sık kanser ve ölümüne neden olan üçüncü önde gelen kanser hem erkek hem de kadınlar için28tanısı var. Kolorektal kanser Batı dünyasının29ana ölümüne neden olan kanser biridir. Kolorektal kanser ve Alzheimer hastalığı yaşlanma ile ilişkili olan ve her ikisi de nerede insanlar benzer beslenme alışkanlıkları zevk gelişmiş ülkelerde özellikle oldu çünkü iki hastalık bir şekilde ilişkili. Buna ek olarak, tau-pozitif ve negatif tau kanser hücrelerinin farklı yanıt kemoterapötik ajanlar, örneğin, Paklitaksel16için.

Curcumin Curcuma longa, Hint baharat zerdeçal30ana türevleri biridir. Yüzyıllar boyunca, Güney Asya nüfus zerdeçal günlük olarak besinlerinde tüketilen sahip. Curcumin kolorektal kanser, Alzheimer hastalığı, şeker hastalığı, Kistik fibrozis, inflamatuvar barsak hastalığı, artrit, hiperlipidemi, ateroskleroz ve iskemik kalp hastalığı31, de dahil olmak üzere farklı hastalıkları tedavi etmek için kullanılır 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. lityum veya kolorektal kanser hücrelerini öldürmek de onların nükleer silahların yayılmasına karşı39önlemek. Lityum de tau toplama azalır ve onun hyperphosphorylation bir transgenik fare modeli41,42,43gözlemlediği gibi engeller olarak Alzheimer hastalığı40 tedavi etmek için kullanılabilir, 44.

Bu el yazması amaçlamaktadır: 1) ölçü toplam tau ve fosfo-tau ifade seviyelerinde işlem görmüş hücreleri; 2) genel tau fosforilasyon ölçmek için bir fosfataz tahlil tarif; 3) tau Mikrotubul bağlama incelemek; ve 4) kolorektal kanser hücre çizgiler curcumin veya LiCl ile tedavi confocal mikroskobu tarafından tau yerelleştirilmesine. Sonuçları curcumin ile hücre tedavi, hangi kolon kanseri için sözde iyi bir kemoterapötik Ajan ve tedavi LiCl ile her iki toplam tau ifade azaltabilir ve tau kolorektal kanser hücre hatlarında fosforile olduğunu ortaya koyuyor. Bu tedaviler de tau nükleer translocation neden olabilir. Ancak, beklenmedik bir şekilde, curcumin tau mikrotübüller için bağlama geliştirmek başarısız olur.

Protocol

1. reaktifler hazırlık Ekle 10 µL (1 mM) phenylmethylsulfonyl florür çözüm, 10 µL (1 x 100 x stoktan) proteaz inhibitörü kokteyl çözüm ve 10 µL (1 x 100 x stoktan) fosfataz inhibitörü kokteyl çözüm 1 x radioimmunoprecipitation tahlil (RIPA) arabelleği tam RIPA lizis arabellek hazırlamak için 1 ml. Hazırla 10 x genel tübülin arabellek (PEM) arabellek. Ekle 800 mM (6.0474 g) piperazin-N-N ' – bis – 2-ethanesulfonic asit, 10 mM (95,1 mg) etilen glik…

Representative Results

Toplam tau ve fosfo-tau ifadesi curcumin veya LiCl (şekil 1) farklı konsantrasyonları hücrelerle tedavi sonra incelenmiştir. Hücre tedavisi curcumin üç farklı konsantrasyonları ile tau ifade seviyeleri azalma; Ancak, fosfo-tau ifade curcumin düşük konsantrasyon ile tedavi üzerine artmış ama daha yüksek curcumin konsantrasyonları hücrelerle tedavi üzerine düşmüştür. Anti-fosfo-tau (Ser396) fosfo-tau tespiti için kullanıldı. LiCl (<s…

Discussion

Bu el yazması toplam tau algılamak için farklı yordam koşullar kurulmuş ve tau curcumin ve LiCl ile tedavi kolorektal kanser hücrelerinde fosforile. Tau protein örneklerinde genel fosforilasyon durumunu değerlendirmek için fosfataz tahlil tanımlanmıştır. Bu tahlil herhangi bir protein fosforilasyon durumunu incelemek için kullanılabilir.

Bu tahlil protein hamle sigara fosforile durumuna yavaş fosforile ilkesine dayanır. Alkalen fosfataz ve alkalen fosfataz arabellek bu protok…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Projenin bir parçası ‘Kalkınma ve sanayileşme yüksek değer kozmetik hammadde deniz mikroalg’ başlıklı, okyanuslar Bakanlığı ve balıkçılık, Kore tarafından finanse edilen ve intramural grant (2Z04930) tarafından desteklenen bu araştırma gerçekleştirildi Doğal ürünlerin KIST nin Gangneung Enstitüsü ‘.

Materials

HCT 116 cell ATCC CCL-247
MEM (EBSS) Hyclone SH30024.01
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher (Gibco) 16000044 Store at -20 °C
penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
Trypsin-EDTA solution WelGene LS 015-01
100 mm dish Corning 430161
6 well plate Corning Coster 3516
Anti-Tau 13 antibody abcam ab19030
Dithiothreitol (DTT) Roche 10 708 984 001 Storage Temperature 2–8 °C
Microlitre Centrifuges Hettich Zentrifugen MIKRO 200 R
Paclitaxel Sigma-Aldrich T1912 Storage Temperature 2–8 °C
Curcumin Sigma-Aldrich (Fluka) 78246 Storage Temperature 2–8 °C
Microtubules (MT) Cytoskeleton MT001 Store at 4 °C (desiccated)
Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200 Store at 4 °C in the dark
Sodium hydroxide Sigma 72068
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M2670
GTP Sigma-Aldrich G8877 Store at -20 °C
DPBS WelGene LB 001-02
Sonic Dismembrator Fisher Scientific Model 500
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-100 XP
PIPES Sigma P1851
Bovine serum Albumin (BSA) Sigma A7906
Molecular Imager Bio-Rad ChemiDoc XRS+ Store at 4 °C
Protein assay dye reagent Bio-Rad 500-0006
α-tubulin (11H10) Rabbit mAb Cell signalling 2125
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Cell signalling 2118
Anti-Tau (phospho S396) antibody abcam ab109390
EGTA Sigma E3889 Store at room temperature
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase Thermo Scientific EF0651 Store at -20 °C
PMSF Sigma P7626 Store at room temperature
Phosphatase Inhibitor Cocktail Cell Signalling 5870 Store at 4 °C
Protease Inhibitor Cocktail Cell Signalling 5871 Store at 4 °C
RIPA Buffer Sigma R 0278 Storage Temperature 2–8 °C
Tau-352 human Sigma T 9950 Store at -20 °C
Triton X-100  Sigma-Aldrich X – 100 Store at around 25 °C
PVDF membrane Bio-Rad 162-0177
Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody ThermoFisher A-11005 Store at 4 °C in the dark
Confocal Microscopy Leica Microsystem Leica TCS SP5
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Affymetrix 75819
Protein Assay Bio-Rad 500-0006 Store at 4 °C
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1858-1862 (1975).
  2. Cambiazo, V., Gonzalez, M., Maccioni, R. B. DMAP-85: a tau-like protein from Drosophila melanogaster larvae. J Neurochem. 64, 1288-1297 (1995).
  3. Goedert, M., et al. PTL-1, a microtubule-associated protein with tau-like repeats from the nematode Caenorhabditis elegans. J Cell Sci. 109 (Pt 11), 2661-2672 (1996).
  4. Goedert, M., Spillantini, M. G., Jakes, R., Rutherford, D., Crowther, R. A. Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer’s disease. Neuron. 3, 519-526 (1989).
  5. Cleveland, D. W., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. Purification of tau, a microtubule-associated protein that induces assembly of microtubules from purified tubulin. J Mol Biol. 116, 207-225 (1977).
  6. Fellous, A., Francon, J., Lennon, A. M., Nunez, J. Microtubule assembly in vitro. Purification of assembly-promoting factors. Eur J Biochem. 78, 167-174 (1977).
  7. Witman, G. B., Cleveland, D. W., Weingarten, M. D., Kirschner, M. W. Tubulin requires tau for growth onto microtubule initiating sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 73, 4070-4074 (1976).
  8. Dixit, R., Ross, J. L., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. Differential regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau. Science. 319, 1086-1089 (2008).
  9. Harada, A., et al. Altered microtubule organization in small-calibre axons of mice lacking tau protein. Nature. 369, 488-491 (1994).
  10. Caceres, A., Kosik, K. S. Inhibition of neurite polarity by tau antisense oligonucleotides in primary cerebellar neurons. Nature. 343, 461-463 (1990).
  11. Binder, L. I., Frankfurter, A., Rebhun, L. I. The distribution of tau in the mammalian central nervous system. J Cell Biol. 101, 1371-1378 (1985).
  12. Gu, Y. J., Oyama, F., Ihara, Y. tau is widely expressed in rat tissues. J Neurochem. 67, 1235-1244 (1996).
  13. Kenner, L., et al. Expression of three- and four-repeat tau isoforms in mouse liver. Hepatology. 20, 1086-1089 (1994).
  14. Souter, S., Lee, G. Microtubule-associated protein tau in human prostate cancer cells: isoforms, phosphorylation, and interactions. J Cell Biochem. 108, 555-564 (2009).
  15. Sangrajrang, S., et al. Estramustine resistance correlates with tau over-expression in human prostatic carcinoma cells. Int J Cancer. 77, 626-631 (1998).
  16. Rouzier, R., et al. Microtubule-associated protein tau: a marker of paclitaxel sensitivity in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8315-8320 (2005).
  17. Mimori, K., et al. Reduced tau expression in gastric cancer can identify candidates for successful paclitaxel treatment. Brit J Cancer. 94, 1894-1897 (2006).
  18. Jimeno, A., et al. Development of two novel benzoylphenylurea sulfur analogues and evidence that the microtubule-associated protein tau is predictive of their activity in pancreatic cancer. Mol Cancer Ther. 6, 1509-1516 (2007).
  19. Huda, M. N., Kim, D. H., Erdene-Ochir, E., Kim, Y. S., Pan, C. H. Expression, phosphorylation, localization, and microtubule binding of tau in colorectal cell lines. Appl Biol Chem. 59, 807-812 (2016).
  20. Askanas, V., Engel, W. K., Bilak, M., Alvarez, R. B., Selkoe, D. J. Twisted tubulofilaments of inclusion body myositis muscle resemble paired helical filaments of Alzheimer brain and contain hyperphosphorylated tau. The American journal of pathology. 144, 177-187 (1994).
  21. Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33, 95-130 (2000).
  22. Hanger, D. P., Anderton, B. H., Noble, W. Tau phosphorylation: the therapeutic challenge for neurodegenerative disease. Trends Mol Med. 15, 112-119 (2009).
  23. Sergeant, N., et al. Biochemistry of Tau in Alzheimer’s disease and related neurological disorders. Expert Rev Proteomics. 5, 207-224 (2008).
  24. Fath, T., Eidenmuller, J., Brandt, R. Tau-mediated cytotoxicity in a pseudohyperphosphorylation model of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 22, 9733-9741 (2002).
  25. Kolarova, M., Garcia-Sierra, F., Bartos, A., Ricny, J., Ripova, D. Structure and pathology of tau protein in Alzheimer disease. Int J Alzheimers Dis. 2012, 731526 (2012).
  26. Kosik, K. S., Joachim, C. L., Selkoe, D. J. Microtubule-associated protein tau (tau) is a major antigenic component of paired helical filaments in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4044-4048 (1986).
  27. Wood, J. G., Mirra, S. S., Pollock, N. J., Binder, L. I. Neurofibrillary tangles of Alzheimer disease share antigenic determinants with the axonal microtubule-associated protein tau (tau). Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4040-4043 (1986).
  28. Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2003. CA Cancer J Clin. 53, 5-26 (2003).
  29. Patel, V. B., Misra, S., Patel, B. B., Majumdar, A. P. Colorectal cancer: chemopreventive role of curcumin and resveratrol. Nutr Cancer. 62, 958-967 (2010).
  30. Lim, G. P., et al. The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse. J Neurosci. 21, 8370-8377 (2001).
  31. Venkatesan, N. Curcumin attenuation of acute adriamycin myocardial toxicity in rats. Br J Pharmacol. 124, 425-427 (1998).
  32. Srinivasan, M. Effect of curcumin on blood sugar as seen in a diabetic subject. Indian J Med Sci. 26, 269-270 (1972).
  33. Deodhar, S. D., Sethi, R., Srimal, R. C. Preliminary study on antirheumatic activity of curcumin (diferuloyl methane). Indian J Med Res. 71, 632-634 (1980).
  34. Rao, C. V., Rivenson, A., Simi, B., Reddy, B. S. Chemoprevention of colon carcinogenesis by dietary curcumin, a naturally occurring plant phenolic compound. Cancer Res. 55, 259-266 (1995).
  35. Araujo, C. C., Leon, L. L. Biological activities of Curcuma longa L. Mem Inst Oswaldo Cruz. 96, 723-728 (2001).
  36. Lim, T. G., et al. Curcumin suppresses proliferation of colon cancer cells by targeting CDK2. Cancer Prev Res (Phila). 7, 466-474 (2014).
  37. Ringman, J. M., Frautschy, S. A., Cole, G. M., Masterman, D. L., Cummings, J. L. A potential role of the curry spice curcumin in Alzheimer’s disease. Curr Alzheimer Res. 2, 131-136 (2005).
  38. Li, H., et al. Lithium chloride suppresses colorectal cancer cell survival and proliferation through ROS/GSK-3beta/NF-kappaB signaling pathway. Oxid Med Cell Longev. , 241864 (2014).
  39. Forlenza, O. V., De-Paula, V. J., Diniz, B. S. Neuroprotective effects of lithium: implications for the treatment of Alzheimer’s disease and related neurodegenerative disorders. ACS Chem Neurosci. 5, 443-450 (2014).
  40. Noble, W., et al. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by lithium correlates with reduced tauopathy and degeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6990-6995 (2005).
  41. Perez, M., Hernandez, F., Lim, F., Diaz-Nido, J., Avila, J. Chronic lithium treatment decreases mutant tau protein aggregation in a transgenic mouse model. J Alzheimers Dis. 5, 301-308 (2003).
  42. Engel, T., Goni-Oliver, P., Lucas, J. J., Avila, J., Hernandez, F. Chronic lithium administration to FTDP-17 tau and GSK-3beta overexpressing mice prevents tau hyperphosphorylation and neurofibrillary tangle formation, but pre-formed neurofibrillary tangles do not revert. J Neurochem. 99, 1445-1455 (2006).
  43. Caccamo, A., Oddo, S., Tran, L. X., LaFerla, F. M. Lithium reduces tau phosphorylation but not A beta or working memory deficits in a transgenic model with both plaques and tangles. Am J Pathol. 170, 1669-1675 (2007).
  44. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  45. Gupta, K. K., Bharne, S. S., Rathinasamy, K., Naik, N. R., Panda, D. Dietary antioxidant curcumin inhibits microtubule assembly through tubulin binding. FEBS J. 273, 5320-5332 (2006).
  46. Lee, J. W., Park, S., Kim, S. Y., Um, S. H., Moon, E. Y. Curcumin hampers the antitumor effect of vinblastine via the inhibition of microtubule dynamics and mitochondrial membrane potential in HeLa cervical cancer cells. Phytomedicine. 23, 705-713 (2016).
  47. Liu, F., et al. Site-specific effects of tau phosphorylation on its microtubule assembly activity and self-aggregation. Eur J Neurosci. 26, 3429-3436 (2007).
  48. Sultan, A., et al. Nuclear tau, a key player in neuronal DNA protection. J Biol Chem. 286, 4566-4575 (2011).
  49. Bukar Maina, M., Al-Hilaly, Y. K., Serpell, L. C. Nuclear Tau and Its Potential Role in Alzheimer’s Disease. Biomolecules. 6, 9 (2016).
  50. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9, 790-803 (2010).

Tags

Tau PhosphorylationMicrotubule BindingTau LocalizationConfocal MicroscopyColorectal Cancer CellsPhosphatase AssayMicrotubule-binding AssayTau ProteinHCT 116 CellsCurcuminLithium ChlorideRIPA BufferBradford AssayAlkaline Phosphatase

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Huda, M. N., Erdene-Ochir, E., Pan, C. Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells. J. Vis. Exp. (128), e55932, doi:10.3791/55932 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image