JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

Assay для фосфорилирования и привязки микротрубочек наряду с локализацией тау белка в клетках рака прямой кишки

Published: October 10, 2017
doi:
10.3791/55932
, ,
1Systems Biotechnology Research Center,KIST Gangneung Institute of Natural Products, 2Division of Bio-Medical Science & Technology, KIST School,Korea University of Science and Technology

Summary

Эта рукопись описывает стандартные протоколы для измерения Тау hyperphosphorylation, измерения Тау привязки микротрубочек и локализация внутриклеточных Тау, после медикаментозного лечения. Эти протоколы могут использоваться многократно для скрининга наркотиков или других соединений, которые нацелены Тау hyperphosphorylation или микротрубочек привязки.

Abstract

Микротрубочки связанные белка Тау — нейронов белок, локализуется преимущественно в аксонов. Как правило Тау имеет важное значение для нормального функционирования нейронов, потому что он участвует в Ассамблее микротрубочек и стабилизации. Кроме того, нейроны Тау выражается в груди человека и предстательной железы, желудка, толстой кишки, поджелудочной железы, где он показывает почти аналогичные структуры и оказывает аналогичные функции как нейрональных Тау. Количество Тау и его фосфорилирование может изменить свою функцию как стабилизатор микротрубочек и привести к развитию парных винтовой нитей в различных нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера. Определение состояния фосфорилирование Тау и его характеристики микротрубочек привязки имеет важное значение. Кроме того изучение внутриклеточной локализации Тау имеет важное значение в различных заболеваний. Эта рукопись детали стандартные протоколы для измерения Тау фосфорилирования и Тау связывание микротрубочек в клетках рака прямой кишки с или без куркумин и LiCl лечения. Эти процедуры может использоваться для остановки распространения раковых клеток и развитию. Внутриклеточной локализации Тау проверяется с помощью иммуногистохимии и конфокальная микроскопия при использовании низкого количества антител. Эти анализы могут использоваться многократно для проверки соединений, которые влияют на hyperphosphorylation Тау или привязки микротрубочек. Роман терапии используется для различных tauopathies или потенциально связанные противоопухолевых агентов можно охарактеризовать с помощью этих протоколов.

Introduction

Тау первоначально была определена как тепло stable микротрубочек связанный белок, который был совместной очищенную с тубулин1. Тау исключительно выражается в высших эукариот2,3,4. Основная функция Тау является контроль микротрубочек Ассамблея1,5,6. Он также способствует полимеризации микротрубочек7, аксональное транспорта8, изменения в аксональное диаметр9, формирование Неврома полярности, и нейродегенеративные10. Тау также действует как белка лески для управления некоторые сигнальные пути. Исследования мозга крысы предположить что Тау нейрон конкретной и что он локализуется преимущественно в аксоны11. Потому что Тау имеет важное значение для полимеризации микротрубочек и развития нервной системы, Тау был предположить, чтобы играть важную роль в аксональное развития центральной нервной системы; Эта гипотеза была позднее подтверждена экспериментах in vitro и in vivo . В дополнение к нейронов Тау выражается в различных не нейрональных клеток, включая печень, почки и мышечные клетки12,13. Тау выражается также в груди человека, простаты, толстой кишки, желудка и рака поджелудочной железы клетки линии и тканей14,15,16,17,18, 19. Тау встречается также в миозит включение тело как витой tubulofilaments включения органов20.

Тау могут нести несколько столб-поступательные изменения. Из всех столб-поступательные изменения фосфорилирование является наиболее распространенным. Увеличение Тау фосфорилирование уменьшается его сродство для микротрубочек, наконец дестабилизации цитоскелета. Восемьдесят пять фосфорилирование сайты были описаны в белка Тау, изолированных от тканей мозга человека болезни Альцгеймера. Из этих сайтов 53% составляют Серин, треонин 41% и только 6% тирозин остатков21,22,23. Тау фосфорилирование влияет на его локализации, функции, привязки, растворимость и его восприимчивости к другой столб-поступательные изменения. Также Тау фосфорилирование более чем нормальной степени (или полностью насыщенных с фосфатными группами) известен как hyperphosphorylation, которая реплицирует структурные и функциональные характеристики болезни Альцгеймера24. Тау поддерживает надлежащее функционирование аксональное микротрубочек и обеспечивает нормальное функционирование нейронов в физиологических условиях. Однако hyperphosphorylated Тау не поддерживать привязку хорошо организованной микротрубочек, гибели нейронов вследствие микротрубочек разборки. Нормальные уровни Тау фосфорилирование необходимы для надлежащего функционирования Тау, но Тау не может нормально функционировать, если его характерные фосфорилирование уровень изменяется, и если это hyperphosphorylated25. В болезни Альцгеймера и некоторые другие связанные с возрастом нейродегенеративных расстройств Тау становится hyperphosphorylated и образует парные спиральные нити и нейрофибриллярных клубков26,27. Таким образом важное значение имеют методы определения Тау фосфорилирования и микротрубочек привязки.

Колоректальный рак, старение связанных, является третьим наиболее часто диагноз рака и третий выдающийся причиной смерти для мужчин и женщин28. Колоректальный рак является одной из главной причиной смерти рака в западном мире29. Потому что колоректального рака и болезни Альцгеймера, связанные со старением, и оба происходят главным образом в развитых странах, где люди наслаждаются аналогичные пищевые привычки, двух заболеваний могут быть каким-то образом связаны. Кроме того Тау позитивных и негативных Тау раковые клетки реагируют по-разному химиотерапевтических агентов, например, паклитаксел16.

Куркумин является одним из основных производных Куркума longa, индийские специи куркумы30. На протяжении веков Южной Азии населения потребляли куркумы в их диетпитаниях на ежедневной основе. Куркумин используется для лечения различных заболеваний, включая колоректальный рак, болезнь Альцгеймера, диабет, кистозный фиброз, воспалительные заболевания кишечника, артрит, гиперлипидемия, атеросклероз и ишемическая болезнь сердца31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. лития может также убить колоректальные раковые клетки или предотвращения их распространения39. Лития может также использоваться для лечения болезни Альцгеймера40 , как он уменьшает Тау агрегации и предотвращает его hyperphosphorylation, как отмечено в трансгенные мыши модель41,,4243, 44.

Эта рукопись направлена на: 1) измеряют всего Тау и уровни выражения фосфо Тау в очищенной ячейки; 2) описывают фосфатазы пробирного для измерения общей Тау фосфорилирования; 3) изучить микротрубочек привязки Тау; и 4) локализовать Тау, confocal микроскопии в клеточных линиях колоректального рака лечение куркумин или LiCl. Результаты показывают, что клеток лечение с куркумин, который якобы хорошего химиотерапевтического агента для рака толстой кишки, и лечение с LiCl может уменьшить выражение как общая Тау и фосфорилированных Тау в colorectal рак клеточных линий. Эти процедуры могут также вызвать ядерный транслокации Тау. Однако неожиданно, куркумин не улучшить связывание Тау микротрубочек.

Protocol

1. Подготовка реагентов Добавить 10 мкл (1 мм) phenylmethylsulfonyl фторида раствор, 10 мкл (1 x из 100 x запасов) ингибитор протеазы коктейль решения и 10 мкл (1 x из 100 x запасов) фосфатазы ингибитор коктейль решение по 1 мл 1 x radioimmunoprecipitation проба (RIPA) буфера подготовить полный буфера lysis RIPA. Подг…

Representative Results

Выражение всего Тау и фосфо Тау был рассмотрен после лечения клетки с различной концентрации куркумин или LiCl (рис. 1). Лечение клеток с трех различных концентрации куркумин снизились уровни выражения Тау; фосфо Тау выражение увеличилось после лечения с …

Discussion

Эта рукопись учредил различные процедурные условия для обнаружения всего Тау и фосфорилированных Тау в клетках колоректального рака, обработанных с куркумин и LiCl. Чтобы оценить общее состояние фосфорилирование Тау в образцы протеина, фосфатазы пробирного был описан. Этот assay потенциа…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было выполнено как частью проекта под названием «Развитие и индустриализации высокое значение косметического сырья из морских водорослей», финансируемого министерством океанов и рыболовства, Корея и была поддержана интрамуральных Грант (2Z04930) от института Каннын в KIST натуральных продуктов.

Materials

HCT 116 cell ATCC CCL-247
MEM (EBSS) Hyclone SH30024.01
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher (Gibco) 16000044 Store at -20 °C
penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
Trypsin-EDTA solution WelGene LS 015-01
100 mm dish Corning 430161
6 well plate Corning Coster 3516
Anti-Tau 13 antibody abcam ab19030
Dithiothreitol (DTT) Roche 10 708 984 001 Storage Temperature 2–8 °C
Microlitre Centrifuges Hettich Zentrifugen MIKRO 200 R
Paclitaxel Sigma-Aldrich T1912 Storage Temperature 2–8 °C
Curcumin Sigma-Aldrich (Fluka) 78246 Storage Temperature 2–8 °C
Microtubules (MT) Cytoskeleton MT001 Store at 4 °C (desiccated)
Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200 Store at 4 °C in the dark
Sodium hydroxide Sigma 72068
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M2670
GTP Sigma-Aldrich G8877 Store at -20 °C
DPBS WelGene LB 001-02
Sonic Dismembrator Fisher Scientific Model 500
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-100 XP
PIPES Sigma P1851
Bovine serum Albumin (BSA) Sigma A7906
Molecular Imager Bio-Rad ChemiDoc XRS+ Store at 4 °C
Protein assay dye reagent Bio-Rad 500-0006
α-tubulin (11H10) Rabbit mAb Cell signalling 2125
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Cell signalling 2118
Anti-Tau (phospho S396) antibody abcam ab109390
EGTA Sigma E3889 Store at room temperature
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase Thermo Scientific EF0651 Store at -20 °C
PMSF Sigma P7626 Store at room temperature
Phosphatase Inhibitor Cocktail Cell Signalling 5870 Store at 4 °C
Protease Inhibitor Cocktail Cell Signalling 5871 Store at 4 °C
RIPA Buffer Sigma R 0278 Storage Temperature 2–8 °C
Tau-352 human Sigma T 9950 Store at -20 °C
Triton X-100  Sigma-Aldrich X – 100 Store at around 25 °C
PVDF membrane Bio-Rad 162-0177
Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody ThermoFisher A-11005 Store at 4 °C in the dark
Confocal Microscopy Leica Microsystem Leica TCS SP5
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Affymetrix 75819
Protein Assay Bio-Rad 500-0006 Store at 4 °C
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1858-1862 (1975).
  2. Cambiazo, V., Gonzalez, M., Maccioni, R. B. DMAP-85: a tau-like protein from Drosophila melanogaster larvae. J Neurochem. 64, 1288-1297 (1995).
  3. Goedert, M., et al. PTL-1, a microtubule-associated protein with tau-like repeats from the nematode Caenorhabditis elegans. J Cell Sci. 109 (Pt 11), 2661-2672 (1996).
  4. Goedert, M., Spillantini, M. G., Jakes, R., Rutherford, D., Crowther, R. A. Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer’s disease. Neuron. 3, 519-526 (1989).
  5. Cleveland, D. W., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. Purification of tau, a microtubule-associated protein that induces assembly of microtubules from purified tubulin. J Mol Biol. 116, 207-225 (1977).
  6. Fellous, A., Francon, J., Lennon, A. M., Nunez, J. Microtubule assembly in vitro. Purification of assembly-promoting factors. Eur J Biochem. 78, 167-174 (1977).
  7. Witman, G. B., Cleveland, D. W., Weingarten, M. D., Kirschner, M. W. Tubulin requires tau for growth onto microtubule initiating sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 73, 4070-4074 (1976).
  8. Dixit, R., Ross, J. L., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. Differential regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau. Science. 319, 1086-1089 (2008).
  9. Harada, A., et al. Altered microtubule organization in small-calibre axons of mice lacking tau protein. Nature. 369, 488-491 (1994).
  10. Caceres, A., Kosik, K. S. Inhibition of neurite polarity by tau antisense oligonucleotides in primary cerebellar neurons. Nature. 343, 461-463 (1990).
  11. Binder, L. I., Frankfurter, A., Rebhun, L. I. The distribution of tau in the mammalian central nervous system. J Cell Biol. 101, 1371-1378 (1985).
  12. Gu, Y. J., Oyama, F., Ihara, Y. tau is widely expressed in rat tissues. J Neurochem. 67, 1235-1244 (1996).
  13. Kenner, L., et al. Expression of three- and four-repeat tau isoforms in mouse liver. Hepatology. 20, 1086-1089 (1994).
  14. Souter, S., Lee, G. Microtubule-associated protein tau in human prostate cancer cells: isoforms, phosphorylation, and interactions. J Cell Biochem. 108, 555-564 (2009).
  15. Sangrajrang, S., et al. Estramustine resistance correlates with tau over-expression in human prostatic carcinoma cells. Int J Cancer. 77, 626-631 (1998).
  16. Rouzier, R., et al. Microtubule-associated protein tau: a marker of paclitaxel sensitivity in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8315-8320 (2005).
  17. Mimori, K., et al. Reduced tau expression in gastric cancer can identify candidates for successful paclitaxel treatment. Brit J Cancer. 94, 1894-1897 (2006).
  18. Jimeno, A., et al. Development of two novel benzoylphenylurea sulfur analogues and evidence that the microtubule-associated protein tau is predictive of their activity in pancreatic cancer. Mol Cancer Ther. 6, 1509-1516 (2007).
  19. Huda, M. N., Kim, D. H., Erdene-Ochir, E., Kim, Y. S., Pan, C. H. Expression, phosphorylation, localization, and microtubule binding of tau in colorectal cell lines. Appl Biol Chem. 59, 807-812 (2016).
  20. Askanas, V., Engel, W. K., Bilak, M., Alvarez, R. B., Selkoe, D. J. Twisted tubulofilaments of inclusion body myositis muscle resemble paired helical filaments of Alzheimer brain and contain hyperphosphorylated tau. The American journal of pathology. 144, 177-187 (1994).
  21. Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33, 95-130 (2000).
  22. Hanger, D. P., Anderton, B. H., Noble, W. Tau phosphorylation: the therapeutic challenge for neurodegenerative disease. Trends Mol Med. 15, 112-119 (2009).
  23. Sergeant, N., et al. Biochemistry of Tau in Alzheimer’s disease and related neurological disorders. Expert Rev Proteomics. 5, 207-224 (2008).
  24. Fath, T., Eidenmuller, J., Brandt, R. Tau-mediated cytotoxicity in a pseudohyperphosphorylation model of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 22, 9733-9741 (2002).
  25. Kolarova, M., Garcia-Sierra, F., Bartos, A., Ricny, J., Ripova, D. Structure and pathology of tau protein in Alzheimer disease. Int J Alzheimers Dis. 2012, 731526 (2012).
  26. Kosik, K. S., Joachim, C. L., Selkoe, D. J. Microtubule-associated protein tau (tau) is a major antigenic component of paired helical filaments in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4044-4048 (1986).
  27. Wood, J. G., Mirra, S. S., Pollock, N. J., Binder, L. I. Neurofibrillary tangles of Alzheimer disease share antigenic determinants with the axonal microtubule-associated protein tau (tau). Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4040-4043 (1986).
  28. Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2003. CA Cancer J Clin. 53, 5-26 (2003).
  29. Patel, V. B., Misra, S., Patel, B. B., Majumdar, A. P. Colorectal cancer: chemopreventive role of curcumin and resveratrol. Nutr Cancer. 62, 958-967 (2010).
  30. Lim, G. P., et al. The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse. J Neurosci. 21, 8370-8377 (2001).
  31. Venkatesan, N. Curcumin attenuation of acute adriamycin myocardial toxicity in rats. Br J Pharmacol. 124, 425-427 (1998).
  32. Srinivasan, M. Effect of curcumin on blood sugar as seen in a diabetic subject. Indian J Med Sci. 26, 269-270 (1972).
  33. Deodhar, S. D., Sethi, R., Srimal, R. C. Preliminary study on antirheumatic activity of curcumin (diferuloyl methane). Indian J Med Res. 71, 632-634 (1980).
  34. Rao, C. V., Rivenson, A., Simi, B., Reddy, B. S. Chemoprevention of colon carcinogenesis by dietary curcumin, a naturally occurring plant phenolic compound. Cancer Res. 55, 259-266 (1995).
  35. Araujo, C. C., Leon, L. L. Biological activities of Curcuma longa L. Mem Inst Oswaldo Cruz. 96, 723-728 (2001).
  36. Lim, T. G., et al. Curcumin suppresses proliferation of colon cancer cells by targeting CDK2. Cancer Prev Res (Phila). 7, 466-474 (2014).
  37. Ringman, J. M., Frautschy, S. A., Cole, G. M., Masterman, D. L., Cummings, J. L. A potential role of the curry spice curcumin in Alzheimer’s disease. Curr Alzheimer Res. 2, 131-136 (2005).
  38. Li, H., et al. Lithium chloride suppresses colorectal cancer cell survival and proliferation through ROS/GSK-3beta/NF-kappaB signaling pathway. Oxid Med Cell Longev. , 241864 (2014).
  39. Forlenza, O. V., De-Paula, V. J., Diniz, B. S. Neuroprotective effects of lithium: implications for the treatment of Alzheimer’s disease and related neurodegenerative disorders. ACS Chem Neurosci. 5, 443-450 (2014).
  40. Noble, W., et al. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by lithium correlates with reduced tauopathy and degeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6990-6995 (2005).
  41. Perez, M., Hernandez, F., Lim, F., Diaz-Nido, J., Avila, J. Chronic lithium treatment decreases mutant tau protein aggregation in a transgenic mouse model. J Alzheimers Dis. 5, 301-308 (2003).
  42. Engel, T., Goni-Oliver, P., Lucas, J. J., Avila, J., Hernandez, F. Chronic lithium administration to FTDP-17 tau and GSK-3beta overexpressing mice prevents tau hyperphosphorylation and neurofibrillary tangle formation, but pre-formed neurofibrillary tangles do not revert. J Neurochem. 99, 1445-1455 (2006).
  43. Caccamo, A., Oddo, S., Tran, L. X., LaFerla, F. M. Lithium reduces tau phosphorylation but not A beta or working memory deficits in a transgenic model with both plaques and tangles. Am J Pathol. 170, 1669-1675 (2007).
  44. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  45. Gupta, K. K., Bharne, S. S., Rathinasamy, K., Naik, N. R., Panda, D. Dietary antioxidant curcumin inhibits microtubule assembly through tubulin binding. FEBS J. 273, 5320-5332 (2006).
  46. Lee, J. W., Park, S., Kim, S. Y., Um, S. H., Moon, E. Y. Curcumin hampers the antitumor effect of vinblastine via the inhibition of microtubule dynamics and mitochondrial membrane potential in HeLa cervical cancer cells. Phytomedicine. 23, 705-713 (2016).
  47. Liu, F., et al. Site-specific effects of tau phosphorylation on its microtubule assembly activity and self-aggregation. Eur J Neurosci. 26, 3429-3436 (2007).
  48. Sultan, A., et al. Nuclear tau, a key player in neuronal DNA protection. J Biol Chem. 286, 4566-4575 (2011).
  49. Bukar Maina, M., Al-Hilaly, Y. K., Serpell, L. C. Nuclear Tau and Its Potential Role in Alzheimer’s Disease. Biomolecules. 6, 9 (2016).
  50. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9, 790-803 (2010).

Tags

Tau PhosphorylationMicrotubule BindingTau LocalizationConfocal MicroscopyColorectal Cancer CellsPhosphatase AssayMicrotubule-binding AssayTau ProteinHCT 116 CellsCurcuminLithium ChlorideRIPA BufferBradford AssayAlkaline Phosphatase

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Huda, M. N., Erdene-Ochir, E., Pan, C. Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells. J. Vis. Exp. (128), e55932, doi:10.3791/55932 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image