Saggio per la fosforilazione e l'associazione dei microtubuli con localizzazione della proteina Tau in cellule di cancro del colon-retto

Tau è stata originariamente identificata come una proteina microtubule-collegata di termo-stabile che è stato co-purificata con tubulina¹. Tau è espresso esclusivamente in più alti eucarioti^2,3,4. La funzione principale di tau è quello di controllare microtubule Assemblea^1,5,6. Contribuisce anche alla polimerizzazione dei microtubuli⁷, trasporto assonale⁸, cambiamenti nel diametro assonale⁹, formazione di neuroma polarità e neurodegenerazione¹⁰. Tau funge anche da un’impalcatura di proteine per controllare alcune vie di segnalazione. Gli studi del cervello di ratto suggeriscono che tau è neurone-specifico e che localizza principalmente in assoni¹¹. Perché tau è essenziale per la polimerizzazione dei microtubuli e sviluppo neuronale, tau è stata supposta per svolgere un ruolo importante nello sviluppo di axonal nel sistema nervoso centrale; Questa ipotesi è stato successivamente verificato da esperimenti in vitro e in vivo . Oltre ai neuroni, tau è espresso in cellule non neuronali differenti, compreso fegato, rene e muscolo cellule^12,13. Tau è espresso anche in umano del seno, della prostata, del colon-retto, gastrica e cancro del pancreas cella linee e tessuti^{14,15,16,17,18, 19}. tau si trova anche nella miosite come twisted tubulofilaments in corpi di inclusione²⁰.

Tau può trasportare parecchie modifiche post-traduzionali. Di tutte le modifiche post-traduzionali, fosforilazione è il più comune. Fosforilazione di tau aumento diminuisce la sua affinità per i microtubuli, infine destabilizzare il citoscheletro. Siti di fosforilazione di ottantacinque sono stati descritti nella proteina tau isolato dai tessuti di cervello umano del morbo di Alzheimer. Di questi siti, 53% costituiscono serina, treonina 41% e solo 6% tirosina residui^21,22,23. La fosforilazione di Tau influisce sulla sua localizzazione, funzione, associazione, solubilità e della sua suscettibilità ad altre modificazioni post-traduzionali. Anche la fosforilazione di tau a oltre la misura normale (o completamente saturo con gruppi fosfato) è conosciuto come iperfosforilazione che replica le caratteristiche strutturali e funzionali del morbo di Alzheimer²⁴. Tau mantiene il corretto funzionamento dei microtubuli assonali e assicura il normale funzionamento neuronale in condizioni fisiologiche. Tuttavia, tau iperfosforilata non riesce a mantenere un’associazione ben organizzata dei microtubuli, causando la perdita di un neurone a causa di disassemblaggio dei microtubuli. Sono necessari per tau corretto funzionamento normali livelli di fosforilazione di tau, ma tau non riesce a funzionare normalmente se il livello di fosforilazione caratteristico è alterato e se è hyperphosphorylated²⁵. Nel morbo di Alzheimer e di alcuni altri disordini neurodegenerative relativi all’età, tau diventa hyperphosphorylated e forma i filamenti elicoidali accoppiati e grovigli neurofibrillary^26,27. Così, i metodi per determinare la fosforilazione di tau e associazione dei microtubuli sono importanti.

Cancro colorettale, un cancro di invecchiamento-collegato, è che il terzo più frequentemente diagnosticato cancro e il terzo cancro prominente di causa di morte per uomini e donne²⁸. Il cancro colorettale è uno dei cancri più principali causa di morte nel mondo occidentale²⁹. Perché sia cancro colorettale e morbo di Alzheimer sono associate con l’invecchiamento e sia capita soprattutto nei paesi sviluppati, dove le persone godono simili abitudini alimentari, le due malattie possono in qualche modo essere correlate. Inoltre, le cellule tumorali tau-positivi e negativi tau rispondono in modo diverso agli agenti chemioterapeutici, ad es., paclitaxel¹⁶.

La curcumina è uno dei principali derivati di Curcuma longa, la curcuma spezia indiana³⁰. Per secoli, popolazioni sud asiatiche hanno consumato curcuma nella loro dieta su base giornaliera. La curcumina è usata per trattare diverse patologie, compreso cancro colorettale, morbo di Alzheimer, diabete, fibrosi cistica, malattie infiammatorie intestinali, artrite, iperlipidemia, aterosclerosi e malattia cardiaca ischemica^{31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38}. al litio può anche uccidere le cellule tumorali del colon-retto o prevenire la loro proliferazione³⁹. Litio può essere utilizzato anche per il trattamento del morbo di Alzheimer⁴⁰ come si diminuisce l’aggregazione di tau e impedisce la sua iperfosforilazione come osservato in un topo transgenico modello^{41,42,43, 44}.

Questo manoscritto si propone di: 1) misurare la tau totale e livelli di espressione di phospho-tau in cellule trattate; 2) descrivere un’analisi della fosfatasi per misurare la fosforilazione di tau complessiva; 3) esaminare microtubule-leganti di tau; e 4) localizzare tau mediante microscopia confocale in linee cellulari di cancro colorettale trattate con curcumina o LiCl. I risultati rivelano che il trattamento delle cellule con la curcumina, che è un agente chemioterapeutico apparentemente buono per tumore del colon, e trattamento con LiCl può ridurre l’espressione di entrambi tau totale e fosforilato tau in linee cellulari di cancro colorettale. Questi trattamenti possono anche causare la traslocazione nucleare di tau. Tuttavia, inaspettatamente, la curcumina non riesce a migliorare associazione di tau i microtubuli.