Isolatie van Menselijke Myoblasten, Beoordeling van Myogene Differentiatie, en Opslag Met Calcium Ingangsmeting
Summary
Hier beschrijven we een methodologie om een pure bevolking van menselijke myoblasten te verkrijgen uit volwassen spierweefsel. Deze cellen worden gebruikt om in vitro skeletspierdifferentiatie te bestuderen en in het bijzonder om eiwitten die betrokken zijn bij Ca 2+ -signalering te bestuderen.
Abstract
Satellietcellen (SC) zijn spierstamcellen die zich bevinden tussen het plasmamembraan van spiervezels en de omliggende basale lamina. Ze zijn essentieel voor spierregeneratie. Bij letsel, die vaak voorkomt in de skeletspieren, worden SC's geactiveerd. Ze vermenigvuldigen zich als myoblasten en differentiëren om spierlaesies te herstellen. Onder veel gebeurtenissen die plaatsvinden tijdens spierdifferentiatie, zijn cytosolische Ca 2+ signalen van groot belang. Deze Ca 2+ signalen vloeien voort uit Ca 2+ vrijlating van interne Ca 2+ winkels, evenals vanaf Ca 2+ toetreding van de extracellulaire ruimte, in het bijzonder de winkelbedreven Ca 2+ -toets (SOCE). Dit document beschrijft een methodologie die gebruikt wordt om een pure populatie van menselijke myoblasten te verkrijgen uit spiermonsters die zijn verzameld na orthopedische operatie. Het weefsel wordt mechanisch en enzymatisch verteerd en de cellen worden geamplificeerd en vervolgens gesorteerd door flowcytometrie volgens de aanwezigheid van speciFic membraan markers. Eenmaal verkregen worden menselijke myoblasten uitgebreid en toegewijd aan differentiatie door het verwijderen van groeifactoren uit het kweekmedium. De expressieniveaus van specifieke transcriptiefactoren en in vitro immunofluorescentie worden gebruikt om het myogene differentiatieproces in controleomstandigheden te beoordelen en na het afsluiten van eiwitten die betrokken zijn bij Ca 2+ -signalering. Ten slotte beschrijven we het gebruik van Fura-2 als een ratiometrische Ca 2+ sonde die betrouwbare en reproduceerbare metingen van SOCE levert.
Introduction
Menselijke skeletspieren zijn samengesteld uit groepen contractiele, multinucleated spiervezels die voortvloeien uit de fusie van myogene precursorcellen. Skeletspieren hebben de mogelijkheid om na verwonding te regenereren dankzij de aanwezigheid van SC's, de stamcellen van de skeletspier die zich bevinden tussen het plasmamembraan van myofibers (sarcolemma) en de basale lamina. Bij ongebonden spieren zijn SC's meestal aanwezig in een rustige staat. Naar aanleiding van mechanische stress of letsel worden SC's geactiveerd (myoblasten), prolifereren en ondergaan ofwel differentiatie om nieuwe myofibers of zelfvernieuwing te vormen om het SC-pool 1 , 2 aan te vullen. In de loop der jaren werden verschillende technieken ontwikkeld om SC's en hun nakomelingen, de myoblasten, van biopsies van skeletspieren te isoleren. Met het grotere begrip van de celoppervlakmarkers die op deze cellen worden uitgedrukt en de methodologie van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) 3, 4 , 5 , is het nu mogelijk om zuivere populaties van menselijke myoblasten van spiermonsters te isoleren.
Calciumsignaal regelt de ontwikkeling van de skeletspier, homeostase en regeneratie. In het bijzonder is de Ca 2+ -opname die geactiveerd wordt na intracellulaire opslaguitputting, genaamd SOCE, van groot belang 6 voor deze processen. Bij celstimulatie neemt het Ca 2+ -niveau in het endo / sarcoplasmatische reticulum (ER / SR) af, wat op zijn beurt plasma-membraan Ca 2+ kanalen activeert waardoor Ca 2+ toetreding mogelijk is om de ER / SR 7 te vullen. De twee belangrijkste eiwitten die betrokken zijn bij SOCE zijn het ER / SR Ca 2+ -senserende stromale interactie moleculen 1 (STIM1) eiwit en het plasma membraan Ca 2+ kanaal Orai1. Skeletspier spreekt overvloedig deze twee eiwitten uit, evenals andere eiwitten van dezelfde families (STIM2 aNd Orai2-Orai3) 8 , 9 en een aantal Ca 2+ -doorlatende kanalen van de transiënte receptor potentiële kanonieke familie (TRPC) 10 , 11 , 12 , 13 . Ca 2+ toegang via de SOCE route is van groot belang voor spiervorming / regeneratie 14 . Mutaties van STIM1- of Orai1-eiwitten hebben schadelijke effecten op spierfunctie, die hoofdzakelijk leiden tot spierhypotonie 15 . Diermodellen met SOCE-afwijking tonen ook verminderde spiermassa en kracht, samen met verhoogde vermoeidheid 6 , 16 , 17 . Zoals eerder vermeld, worden andere STIM- en Orai-eiwitten, evenals veel TRPC-kanalen, uitgedrukt in de skeletspier, en hun respectieve rollen zijn tot op heden nog niet bepaald. Door te klopt dEigen zijn expressie niveau, het is dus mogelijk om hun implicaties in SOCE en hun rol te onderzoeken tijdens menselijke skeletspierdifferentiatie.
SOCE meting kan worden uitgevoerd met twee verschillende benaderingen: elektrofysiologische actuele opnames en Ca 2+ metingen. Elektrofysiologie is zeker een meer directe methode, aangezien het de huidige interesse en de bijbehorende elektrofysiologische handtekening meet. Deze techniek is echter erg moeilijk om op spiercellen toe te passen, vooral door de grote grootte van de spiercellen en de kleine omvang van de endogene SOCE stroom. Cytosolische Ca 2+ beeldvorming is technisch zeer toegankelijk, maar de maatregel is indirecter, aangezien het Ca 2+ -niveau gemeten in de cytosol zowel de ingang van Ca 2+ als de repomp uit de cel of in de interne winkels weerspiegelt.
Een methodologie die de myoblasten van kleine stukjes menselijke schil omvatEtal spier na enzymatische spijsvertering, amplificatie en FACS wordt uitgelegd in dit document. Het proces van spierdifferentiatie en het immunofluorescentieprotocol om de expressie van differentiatiemarkers over de tijd te volgen worden beschreven 18 . Tenslotte wordt de meting van SOCE en de rol van verschillende ionenkanalen in Ca 2+ signalering en skeletspierdifferentiatie verklaard.
Protocol
Representative Results
Discussion
De isolatie en cultuur van menselijke myoblasten uit volwassen skeletspieren biedt een in vitro model om spierdifferentiatie en spierregeneratie te bestuderen. In dit document verschaffen wij een protocol dat de zuivering van hoge opbrengsten van menselijke myoblasten op een eenvoudige en kosteneffectieve manier mogelijk maakt. Bovendien biedt deze techniek betrouwbare en reproduceerbare resultaten in termen van het percentage geïsoleerde myoblasten en hun myogene differentiati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation (subsidienummer 310030-166313), de "Fondation Suisse pour la recherche sur les maladies musculaires", de "Stichting Marcel Levaillant" en de "Fondation pour la recherche ostéo-articulaire."
Materials
| Ham’s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
| FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
| BSA | Sigma | O5482 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| EGF | Corning | 354001 | |
| Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Creatine | Sigma | 27900 | |
| Pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 ml tube | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 ml tube | Falcon | 352096 | |
| Falcon 5 ml tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
| Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| Mounting medium | Fluka | 10981 | |
| Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | concentrate |
| Mouse anti-myogenin | BD Pharmigen | 556358 | |
| Rabbit anti-MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
| Goat anti-mouse Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
| Mouse anti human CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| Mouse anti human CD146-PECy7 | BD Pharmingen | 562135 | |
| Mouse anti human CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen | 562279 | |
| Mouse anti human CD34-APC | BD Pharmingen | 345804 | |
| Mouse anti human CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| Alexa Fluor 488 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
| PECy7 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC mouse IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE mouse IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | CAUTION: toxic compound |
| Paraformaldehyde | Fluka | 762400 | |
| Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | CAUTION : toxic compound |
| Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. | |||
References
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration. Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
- Chen, W. C., et al. Isolation of blood-vessel-derived multipotent precursors from human skeletal muscle. J Vis Exp. (90), e51195 (2014).
- Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21 (6), 1087-1093 (2012).
- Charville, G. W., et al. Ex Vivo Expansion and In Vivo Self-Renewal of Human Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
- Stiber, J., et al. STIM1 signalling controls store-operated calcium entry required for development and contractile function in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 10 (6), 688-697 (2008).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiol Rev. 95 (4), 1383-1436 (2015).
- Darbellay, B., et al. STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation. J Biol Chem. 284 (8), 5370-5380 (2009).
- Darbellay, B., et al. Human muscle economy myoblast differentiation and excitation-contraction coupling use the same molecular partners, STIM1 and STIM2. J Biol Chem. 285 (29), 22437-22447 (2010).
- Nilius, B., Owsianik, G., Voets, T., Peters, J. A. Transient receptor potential cation channels in disease. Physiol Rev. 87 (1), 165-217 (2007).
- Vandebrouck, C., Martin, D., Colson-Van Schoor, M., Debaix, H., Gailly, P. Involvement of TRPC in the abnormal calcium influx observed in dystrophic (mdx) mouse skeletal muscle fibers. J Cell Bio. 158 (6), 1089-1096 (2002).
- Antigny, F., Koenig, S., Bernheim, L., Frieden, M. During post-natal human myogenesis, normal myotube size requires TRPC1- and TRPC4-mediated Ca(2)(+) entry. J Cell Sci. 126 (11), 2525-2533 (2013).
- Brinkmeier, H. TRP channels in skeletal muscle: gene expression, function and implications for disease. Adv Exp Med Biol. 704, 749-758 (2011).
- Pan, Z., Brotto, M., Ma, J. Store-operated Ca2+ entry in muscle physiology and diseases. BMB Rep. 47 (2), 69-79 (2014).
- Lacruz, R. S., Feske, S. Diseases caused by mutations in ORAI1 and STIM1. Ann N Y Acad Sci. 1356, 45-79 (2015).
- Li, T., et al. STIM1-Ca(2+) signaling is required for the hypertrophic growth of skeletal muscle in mice. Mol Cell Biol. 32 (15), 3009-3017 (2012).
- Wei-Lapierre, L., Carrell, E. M., Boncompagni, S., Protasi, F., Dirksen, R. T. Orai1-dependent calcium entry promotes skeletal muscle growth and limits fatigue. Nat Commun. 4, 2805 (2013).
- Konig, S., et al. Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation. J Biol Chem. 279 (27), 28187-28196 (2004).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bigot, A., et al. Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle. Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).
- Bettadapur, A., et al. Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels. Sci Rep. 6, 28855 (2016).
- Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release. J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).
- Sauc, S., et al. STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER. J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).
- Demaurex, N. Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins. Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).
