عزل ميوبلاستس الإنسان، تقييم التمايز العضلي، وقياس دخول الكالسيوم التي تديرها المخازن
Summary
هنا، نحن تصف منهجية للحصول على السكان النقي من ميوبلاستس الإنسان من الأنسجة العضلية الكبار. وتستخدم هذه الخلايا لدراسة في المختبر التمايز العضلات والهيكل العظمي، وعلى وجه الخصوص، لدراسة البروتينات المشاركة في كا 2 + الإشارات.
Abstract
الخلايا الأقمار الصناعية (سك) هي الخلايا الجذعية العضلية الواقعة بين غشاء البلازما من ألياف العضلات والصفيحة القاعدية المحيطة بها. وهي ضرورية لتجديد العضلات. عند الإصابة، والذي يحدث في كثير من الأحيان في العضلات والهيكل العظمي، يتم تنشيط سس. أنها تتكاثر كما ميوبلاستس والتفريق لإصلاح آفات العضلات. من بين العديد من الأحداث التي تحدث خلال تمايز العضلات، كا 2 عصاري خلوي إشارات ذات أهمية كبيرة. هذه الإشارات كا 2 + تنشأ من كا 2 + الإفراج عن كا 2 + مخازن الداخلية، وكذلك من كا 2 + دخول من الفضاء خارج الخلية، ولا سيما إدخال كا 2+ التي تديرها مخزن (سوس). تصف هذه الورقة المنهجية المستخدمة للحصول على السكان النقي من ميوبلاستس الإنسان من عينات العضلات التي تم جمعها بعد جراحة العظام. يتم هضم الأنسجة ميكانيكيا و إنزيميا، ويتم تضخيم الخلايا ومن ثم فرزها عن طريق التدفق الخلوي وفقا لوجود سبيسيعلامات غشاء فيك. بمجرد الحصول عليها، يتم توسيع ميوبلاستس الإنسان وملتزمة للتمييز عن طريق إزالة عوامل النمو من وسط الثقافة. يتم استخدام مستويات التعبير من عوامل النسخ المحددة والمناعية في المختبر لتقييم عملية التمايز العضلي في ظروف السيطرة وبعد إسكات البروتينات المشاركة في كا 2 + الإشارات. وأخيرا، ونحن بالتفصيل استخدام فورا-2 باعتباره كا 2 راتيوميتريك مسبار التي توفر قياسات موثوقة وقابلة للتكرار من سوس.
Introduction
وتتكون عضلات الهيكل العظمي البشري من مجموعات من الألياف العضلية مقلص، متعددة النوى الناجمة عن انصهار الخلايا السلائف عضلي المنشأ. العضلات الهيكلية لديها القدرة على تجديد بعد الاصابة وذلك بفضل وجود سس، الخلايا الجذعية العضلات والهيكل العظمي تقع بين غشاء البلازما ميوفيبرز (ساركولما) والصفيحة القاعدية. في العضلات غير المصابة، سس موجودة في الغالب في حالة هادئة. ردا على الإجهاد الميكانيكي أو الإصابة، سس تصبح تفعيلها (ميوبلاستس)، تتكاثر، وتخضع إما التمايز لتشكيل ميوفيبرز جديدة أو التجديد الذاتي لتجديد تجمع سك 1 ، 2 . على مر السنين، تم تطوير العديد من التقنيات لعزل سس وذريتها، ميوبلاستس، من خزعات العضلات والهيكل العظمي. مع فهم أكبر من علامات سطح الخلية أعرب عن هذه الخلايا ومنهجية الفلورسنت تنشيط خلية الفرز (فاكس) 3، 4 ، 5 ، فمن الممكن الآن لعزل السكان النقي من ميوبلاستس الإنسان من عينات العضلات.
إشارات الكالسيوم ينظم تطوير العضلات والهيكل العظمي، والتوازن، والتجديد. على وجه الخصوص، كا 2 + دخول التي يتم تنشيطها بعد استنزاف مخزن داخل الخلايا، ودعا سوس، له أهمية كبيرة 6 لهذه العمليات. على التحفيز الخلية، وانخفاض مستوى كا 2 + في الشبكة إندو / ساركوبلازميك (إير / سر)، والذي بدوره ينشط غشاء البلازما كا 2 + القنوات التي تسمح كا 2 + دخول لإعادة ملء إير / سر 7 . البروتينات الرئيسية اثنين المشاركة في سوس هي إير / سر كا 2 + -Sensing التفاعل اللحمية جزيء 1 (STIM1) البروتين وغشاء البلازما كا 2+ قناة Orai1. العضلات والهيكل العظمي يعبر عن هذه البروتينات اثنين، فضلا عن البروتينات الأخرى من نفس الأسر (STIM2 أند Orai2-Orai3) 8 ، 9 والعديد من كا 2+ قنوات -permeable من مستقبلات عابرة كانونيكال (تريك) الأسرة 10 ، 11 ، 12 ، 13 . كا 2 + دخول من خلال مسار سوس هو من أهمية كبيرة لتشكيل العضلات / تجديد 14 . الطفرات من STIM1 أو أوراي 1 البروتينات لها آثار ضارة على وظيفة العضلات، مما يؤدي أساسا إلى نقص التوتر العضلي 15 . نماذج حيوانية مع ضعف سوس كما عرض انخفاض كتلة العضلات والقوة، جنبا إلى جنب مع تعزيز فتيغابيليتي 6 ، 16 ، 17 . كما ذكر، يتم التعبير عن ستيم أخرى والبروتينات أوراي، فضلا عن العديد من القنوات تريك، في العضلات والهيكل العظمي، ولم يتم تحديد أدوار كل منها حتى الآن. بواسطة يطرق دتملك مستوى التعبير، وبالتالي فمن الممكن للتحقيق في آثارها في سوس وأدوارها خلال التمايز العضلات الهيكل العظمي البشري.
ويمكن إجراء قياس سوس باستخدام نهجين مختلفين: التسجيلات الكهربية الحالية والقياسات كا 2 + . الفيزيولوجيا الكهربية هو بالتأكيد طريقة أكثر مباشرة، كما أنه يقيس التيار من الفائدة والتوقيع الكهربية المرتبطة بها. ومع ذلك، هذه التقنية من الصعب جدا أن تنطبق على خلايا العضلات، وذلك أساسا بسبب حجم كبير من خلايا العضلات وصغر حجم التيار سوس الذاتية. سايتوسوليك كا 2 + التصوير هو من الناحية الفنية يمكن الوصول إليها جدا، ولكن التدبير هو أكثر مباشرة، كما كا 2 + مستوى يقاس في السيتوسول يعكس كلا من دخول كا 2 + وإعادة ضخ للخروج من الخلية أو في المخازن الداخلية.
منهجية تشمل عزل ميوبلاستس من قطع صغيرة من سكيل الإنسانإتال العضلات بعد الهضم الأنزيمي، التضخيم، و فاكس هو موضح في هذه الورقة. يتم وصف عملية تمايز العضلات والبروتوكول المناعي لمتابعة التعبير عن علامات التمايز مع مرور الوقت 18 . وأخيرا، يتم شرح قياس سوس ودور القنوات الأيونية المختلفة في كا 2 + الإشارات والتمايز العضلات والهيكل العظمي.
Protocol
Representative Results
Discussion
العزلة والثقافة ميوبلاستس الإنسان من العضلات والهيكل العظمي الكبار يقدم نموذج في المختبر لدراسة التمايز العضلات وتجديد العضلات. في هذه الورقة، ونحن نقدم بروتوكول يسمح لتنقية غلة عالية من ميوبلاستس الإنسان بطريقة بسيطة ومحدودة التكلفة. وبالإ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد حظي هذا العمل بدعم من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (المنحة رقم 310030-166313)، والمؤسسة السويسرية للبحث العلمي، و "مؤسسة مارسيل ليفايلانت"، و "مؤسسة البحث العلمي".
Materials
| Ham’s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
| FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
| BSA | Sigma | O5482 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| EGF | Corning | 354001 | |
| Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Creatine | Sigma | 27900 | |
| Pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 ml tube | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 ml tube | Falcon | 352096 | |
| Falcon 5 ml tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
| Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| Mounting medium | Fluka | 10981 | |
| Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | concentrate |
| Mouse anti-myogenin | BD Pharmigen | 556358 | |
| Rabbit anti-MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
| Goat anti-mouse Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
| Mouse anti human CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| Mouse anti human CD146-PECy7 | BD Pharmingen | 562135 | |
| Mouse anti human CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen | 562279 | |
| Mouse anti human CD34-APC | BD Pharmingen | 345804 | |
| Mouse anti human CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| Alexa Fluor 488 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
| PECy7 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC mouse IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE mouse IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | CAUTION: toxic compound |
| Paraformaldehyde | Fluka | 762400 | |
| Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | CAUTION : toxic compound |
| Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. | |||
References
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration. Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
- Chen, W. C., et al. Isolation of blood-vessel-derived multipotent precursors from human skeletal muscle. J Vis Exp. (90), e51195 (2014).
- Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21 (6), 1087-1093 (2012).
- Charville, G. W., et al. Ex Vivo Expansion and In Vivo Self-Renewal of Human Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
- Stiber, J., et al. STIM1 signalling controls store-operated calcium entry required for development and contractile function in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 10 (6), 688-697 (2008).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiol Rev. 95 (4), 1383-1436 (2015).
- Darbellay, B., et al. STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation. J Biol Chem. 284 (8), 5370-5380 (2009).
- Darbellay, B., et al. Human muscle economy myoblast differentiation and excitation-contraction coupling use the same molecular partners, STIM1 and STIM2. J Biol Chem. 285 (29), 22437-22447 (2010).
- Nilius, B., Owsianik, G., Voets, T., Peters, J. A. Transient receptor potential cation channels in disease. Physiol Rev. 87 (1), 165-217 (2007).
- Vandebrouck, C., Martin, D., Colson-Van Schoor, M., Debaix, H., Gailly, P. Involvement of TRPC in the abnormal calcium influx observed in dystrophic (mdx) mouse skeletal muscle fibers. J Cell Bio. 158 (6), 1089-1096 (2002).
- Antigny, F., Koenig, S., Bernheim, L., Frieden, M. During post-natal human myogenesis, normal myotube size requires TRPC1- and TRPC4-mediated Ca(2)(+) entry. J Cell Sci. 126 (11), 2525-2533 (2013).
- Brinkmeier, H. TRP channels in skeletal muscle: gene expression, function and implications for disease. Adv Exp Med Biol. 704, 749-758 (2011).
- Pan, Z., Brotto, M., Ma, J. Store-operated Ca2+ entry in muscle physiology and diseases. BMB Rep. 47 (2), 69-79 (2014).
- Lacruz, R. S., Feske, S. Diseases caused by mutations in ORAI1 and STIM1. Ann N Y Acad Sci. 1356, 45-79 (2015).
- Li, T., et al. STIM1-Ca(2+) signaling is required for the hypertrophic growth of skeletal muscle in mice. Mol Cell Biol. 32 (15), 3009-3017 (2012).
- Wei-Lapierre, L., Carrell, E. M., Boncompagni, S., Protasi, F., Dirksen, R. T. Orai1-dependent calcium entry promotes skeletal muscle growth and limits fatigue. Nat Commun. 4, 2805 (2013).
- Konig, S., et al. Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation. J Biol Chem. 279 (27), 28187-28196 (2004).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bigot, A., et al. Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle. Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).
- Bettadapur, A., et al. Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels. Sci Rep. 6, 28855 (2016).
- Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release. J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).
- Sauc, S., et al. STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER. J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).
- Demaurex, N. Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins. Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).
