Tatlandırıcı Kodlamanın Yeni Yöntemleri

Dikkat: Manduca tarafından salınan ince, toz halindeki teraziler alerjik olabilir, bu nedenle laboratuvar güvenlik eldivenleri ve bir yüz maskesi kullanılması önerilir. 1. Maksiller sinirleri ve SEZ'yi ortaya çıkarmak için Manduca sexta'nın diseksiyonu Aşağıdaki özelliklere dayalı olarak her iki cinsiyetten de uygun bir güve seçin: Genel olarak sağlıklı bir görünüme sahip eklosiyondan üç gün sonra (kanatlar tamamen uzatılmalı ve burun ve antenler sağlam olmalıdır). Güveleri nakliye için ayrı bir plastik kapa koyun. Güveyi bir polipropilen tüpüne yerleştirin. Dikkat: Güvelerin pul pullarının yayılmasını önlemek için bu adımı bir duman kaputunda yapmanızı öneririz. Tüp, güve gövdesinden biraz daha uzun olmalıdır ( Şekil 1A ). Tüp, 15 mL'lik bir polipropilen tüpü keserek yapılabilir. <li> Güveleri baş açık olana kadar itin ve kelebeğin hareket ettirilmesine yardımcı olmak için tübün diğer ucuna bükülmüş kağıt mendilleri yerleştirin ( Şekil 1A ). Üzerine basınçlı hava üfleyerek kuyruğun maruz kaldığı kafadan (ventral ve dorsal) saçları alın. Basınçlı bir hava kaynağına bir şırınga (1 mL, iğne ile 1.4 mm civarı, keskin uç çıkarılarak ID) bağlanarak hava püskürtülebilir. Not: Saçları çıkardıktan sonra duman kulübesinin dışında aşağıdaki adımları yapabilirsiniz. Bir kere saçın çıkarıldıktan sonra, tüpü, Şekil 1B'de gösterildiği gibi başın dorsal kısmı yukarı bakacak şekilde bir tutma bölmesine yerleştirin. Bir petri kabı üzerinde, modelleme kilini kullanarak yaklaşık 7 cm uzunluğunda, 2.5 cm yüksekliğinde üçgen bir taban oluşturun ( Şekil 1B ). <p class="jove_content" fo:keep-together.within sayfalık = "1"> Şekil 1 : Manduca için Disseksiyon Odasının Hazırlanması. ( A ) Güve bir tüpe konmuştur. Kafa bir ucunda, diğer ucu doku kağıdı ile kapatılmıştır. ( B ) Petri kabı ve modelleme kilinden yapılmış bir diseksiyon odası gösterilmiştir. Kafanın sırt kısmı yukarı bakıyor. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Antenleri ve kene koruyun. Bir tıraş bıçağı ile bir pipet ucu (sarı ipuçları, 1-200 μL) keserek 3 küçük tüp hazırlayın; bunları yaklaşık 0.5 cm uzunluğunda 3 parça halinde tutun. İç çap, anten ve burunların rahatça yerleşebilmesi için yeterince büyük olmalıdır. Tarafından kanca hazırlaBir telin bükülmesi (22 AWG, yaklaşık 7 cm uzunluğunda). Güvesi burnunu uzatın ve tüp memenin proksimal kısmına gelene kadar kablo kancasıyla içeri çekerek küçük tüplerden birine sokun. Küçük tüpü sağlam batik mumu (örneğin balmumu eritmek ve yönlendirmek için bir diş elektrikli balmumu kullanarak) güvelerin baş-kapsülünün sırt kısmına sabitleyin ( Şekil 2A solda). Her bir anteni bir tüp içine yerleştirin ve tüpleri batik mum ile, Şekil 2A'da gösterildiği gibi sabitleyin (sol). Sıcak mumla antenlerin zarar görmesini önlemek için dikkatli olun. Beynin ön yüzeyini kaplayan kasları ( yani bukkal kompresör kası) keserek harekete karşı beyne stabilize edin. Diseksiyon mikroskopu altında mak için baş kapsülünü açmak için bir kürdan yapıştırılmış tıraş ızgarasından yapılmış bir mikro-diseksiyon makası veya mini bir balta kullanın.Burun deliğinin hemen altındaki küçük bir kesim ( Şekil 2A , sol üst yerleştirme). Bukkal kompresör kasını kesmek için mikro-diseksiyon makas kullanın (çizimler için referans 25'e bakın). Kas kolayca görülemediğinden, aşağıdaki davranış testinin kesildiğini teyit etmesi önerilir. 1 M çözelti elde etmek için sakarozu damıtılmış suda seyreltin. Prokositer distal 2 / 3'e yaklaşık 200 mcL sükroz çözeltisi vermek için bir pipet kullanın ve 5 dakika boyunca burun izleyebilirsiniz. Kas düzgün şekilde kesilmişse, böcek uzantısı veya kene hareket ettirmemelidir. Kafa kapsülündeki açıklığı kapatmak için erimiş batik mum katmanını uygulayın. Kafa kapsülünün ventral yüzü yukarı gelecek şekilde böcekleri ters çevirin. Diseksiyon prosedürü sırasında ve sonrasında tuzu perfüze etmek için başın ventral tarafı etrafında bir mum fincan oluşturunElektrikli balmumu: Bir diseksiyon mikroskopu altında başın önüne balmumun ilk sırasını uygulayarak fincan oluşturmaya başlayın ve arkaya doğru hareket edin. Sondayı ve anten tüplerini fincanda tutun ( Şekil 2A sağ). Kapları gözlerin seviyesine gelene kadar dışarı doğru ve yukarı doğru inşa etmeye devam edin. İki labiyal palpozardan birini almak için forseps kullanın, daha sonra yan tarafına yerleştirin ve daha erimiş bal mumu ekleyerek mum bardağına sabitleyin. Aynı şeyi diğer maksiller palpasıyla yapın ( Şekil 2A sağ). Balmumu kabındaki ve tüplerdeki açıklıkları kapatın. Not: Bu aşamada epoksi kullanılır çünkü mumdaki ve borulardaki boşlukları kolayca kapatır ve ısıya bağlı anten ve burun hasarını önler. İkili epoksiyi plastik bir karıştırma kabı içine karıştırmak için bir kürdan kullanın. Karıştırma kabını saklayın. Bir kese uygulamak için kürdan kullanınEpoksi tabakasını kabın içine ve içerisine yerleştirin ( Şekil 2B ). Hortum ve antenleri içeren tüplerin içindeki boşlukları epoksi ile doldurun ve boyayı çevreleyen polipropilen tübün bir kısmını yeterli miktarda epoksi ile doldurarak sıkıca yerine oturtun ( Şekil 2B ). Epoksiyi yaklaşık 20 dakika kurumaya bırakın. Bunu kontrol etmek için plastik karıştırma kabında kalan epoksiyi sağlam ve artık yapışkan olmadığından emin olmak için test edin. Balmumu su bardağını Manduca fizyolojik salin 28 ile doldurun ve kaçak olmadığından emin olmak için birkaç dakika bekleyin. Bir sızıntı görünüyorsa, daha sıcak mum ve / veya epoksi uygulayarak sızdırmazlığı sağlamaya çalışın. Şekil 2 : Manduca </Em> Disseksiyon için. ( A ) Anten ve burun deliği, yaklaşık 0.5 cm uzunluğunda üç parçaya kesilmiş pipet uçlarından yapılmış küçük tüplerin içinde korunmaktadır. (Sol panel, geniş görüntü) Tüpler başın dorsal kısmı etrafına uygulanmış eriyik batik balmumu ile sabitlenmiştir. (Sol panel, inset) Bukkal kompresör kasını çıkarmak için, kafa kapsülünün sırt kısmı, büyük resimdeki noktalı çizgiyle gösterildiği gibi küçük bir kesik açarak açılır. (Sağ panel) Diseksiyon prosedürü ve kayıt deneyleri sırasında perfüze edilmiş salin için bir rezervuar olarak kafanın ventral yanını çevreleyen bir balmumu fincan oluşturulmuştur. ( B ) Epoksi, balmumu kabının tabanı ile başın dorsal kısmı (sol panel) arasındaki boşlukları ve tüplerin açıklıkları da dahil olmak üzere, antenleri ve burunları içeren tüpler arasındaki boşlukları kapatmak için kullanılır (sağ panel ). Lütfen tıklayınız tO bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntüleyin. Diseksiyon mikroskopu altında, labial palpları kesmek için mikro-diseksiyon makası kullanın. Dört kesim yaparak baş kapsülünün ventral yanını açmak için mikro-diseksiyon makası veya bir mini-baltı kullanın: her gözü sırtından öne doğru çevreleyen iki adet kesikli parça, kafanın arka tarafındaki manikürde bir kesim, Ve başın ön tarafı boyunca makasın yanında bir tane kesik ( Şekil 3A ). Beyni açığa çıkarmak için mikro diseksiyon forseps kullanarak nazikçe manikürden çekin. İki keskin mikro-diseksiyon forseps kullanarak, yavaş yavaş ve dikkatli bir şekilde yağ dokusunu ve SEZ'yi kaplayan trakeayı çıkarın. Beyindeki veya sinirlerde herhangi bir hasar (örn., Maksiller sinir, optik sinir, servikal bağlayıcı) kaçının. Beyni sık sık tuz çözeltisini değiştirerek durulayın ve görünürlüğü artırmak için ışığı sık sık ayarlayın. Not: Bu, Di'nin en kritik parçası olabilir.ssection; Maksiller siniri çekerek ya da ezerek yanlışlıkla hasar etmek kolaydır. Not: Bu noktada SEZ ve maksiller sinirler açıkça görülmelidir ( Şekil 3B -3C ). Bununla birlikte beyin ve maksiller sinirler ince bir kılıfla kaplıdır. Kılıfı çıkarmak için, balmumu kabındaki tuzlu suyun, salin içinde çözülmüş% 10 (w / v) kollajenaz / dispaz ile değiştirin ve 5 dakika boyunca yerinde bırakın. Daha sonra, beyin salinle birkaç kez durulandıktan sonra, maksiller sinirler yoluyla SEZ'den kılıfı çekerek süper ince mikro-diseksiyon forsepsiyle kılıfı hafifçe çıkarın. Balmumu fincanı taze tuzlu suyla karıştırmaya başlayın. Tüp bir salin damla hattından balmumu kabına yerleştirin ve eritilmiş mum ile orada sabitleyin. incirUre 3 : Manduca Diseksiyon Prosedürü. ( A ) Labial palpları çıkarıldı, baş kapsülü noktalı çizgi ile gösterildiği gibi dört kesik yaparak açıldı. ( B ) Baş kapsülü açtıktan ve maksiller sinirlerin (MxNs) ve alt özofagus zonunun (SEZ, beyindeki bölgeye atıf yapan bir terim görselleştirme sağlayan, yağ dokusu ve trakeayı çıkardıktan sonra beynin büyütülmüş bir görüntüsü. yemek borusu). Maksiller sinirler, burun burunundaki tatlılık reseptör nöronlarından (SEB) akson taşırlar. ( C ) Bir Manduca beyin şeması. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. 2. Tatlandırıcı Teslim Sistemi Tat verici dağıtım sistemi dört ana unsurdan oluşur: su kaynağı, tat verici manifold, renk sensörü veTümü sert bir plastik boruya bağlanmış ( Şekil 4A- 4B ). Bu sistemi oluşturmak için Şekil 4B'de gösterilen adımları izleyin. Yaklaşık 6 cm uzunluğunda (KİMLİĞİ 0,3 cm) sert bir plastik tüp kullanın. Hortumun yerleştirileceği tüpte küçük bir delik açmak için havyayı kullanın ( Şekil 4A- B ). Farklı hayvanların sünnetlerinin daima aynı yere yerleştirilmesini sağlamak için plastik tarama malzemesi (örgü, yaklaşık 0.1 cm'lik delik boyutu) tüp içine takın ( Şekil 4A- 4B ). Tıraş âleti veya döner bir alet ile sert boru, burun deliğinin yaklaşık 5 mm üzerinde kesilir. Örgüyü iki tüp parçası arasına yerleştirin. Örgüyü sabitleyin ve tüplerin dışına epoksi uygulayarak boruları yeniden bağlayın. Epoksiyi yaklaşık 20 dakika kurumaya bırakın. Tastant verimi için basınçlıGerektiği kadar çok tastant tüpü olan bir perfüzyon sistemi, bir manifolda bağlandı (aşağıya bakın). Örgü üzerinde yaklaşık 1 cm yüksekliğindeki boruya küçük bir delik açmak için havyayı kullanın. Çıktı tüpünü perfüzyon sisteminden (ID 0.86 mm) sert boruya yerleştirin ve epoksi uygulayarak ( Şekil 4A- 4B ) sabitleyin . Sabit bir akış (~ 40 mL / dakika) damıtılmış su sağlamak için peristaltik pompa kullanın. Sert boruya silikon boru ile bağlayın ( Şekil 4A -4C ). Rijit tüpün diğer tarafını, büyük bir atık kabına yönlendirmek için başka bir silikon boruya bağlayın ( Şekil 4A -4C ). Tatlandırıcıyı vermek için sıkıştırılmış hava perfüzyon sisteminin manifolduna enjekte edilmelidir. Bu, örneğin, manifolda sıkıştırılmış havayı enjekte etmek için zamanlanmış voltaj puls girişi ile kontrol edilen bir pnömatik pompa (10 psi) kullanılarak başarılabilir D tüpü ile yıkandı. Bir 1s darbe yaklaşık 0.5 mL tastant atar. 3. Tastant Hazırlama ve İzleme Tadantı Teslimatı Tastant'ı istenilen konsantrasyona kadar damıtılmış suda inceltin. Tatlandırıcının su akışı ile daha da seyreltileceğini unutmayın. İlk konsantrasyonun% 77'si olarak burun deliğine ulaşan nihai konsantrasyonu ölçtük (bkz. Referanslar 10 , 29 ). Her bir tastant solüsyonuna suni bir gıda boyası ekleyin ve tadının patronun üzerinden geçen kesin zamanlamasını belirleyin. % 0.05 w / v'de yeşil boya ( Madde Listesine bakın) Manduca GRN'leri aktive etmediğini bulduk. Tostantı solüsyonlarındaki gıda boyalarını tespit etmek için bir renk sensörü (bkz. Tablo 1) kullanın. Örgüye komşu bir delik açmak ve perfüzyon sisteminin çıkış tüpünün 0,5 cm altında bir delik açmak için lehimleme aleti kullanın ( S = "xfig"> Şekil 4A-4B). Sensörü sert boruya bağlayın ve dışarıda epoksi uygulayarak orada sabitleyin. Renk sensörü voltaj çıkışını, fizyolojik sinyaller ile birlikte bir analog sinyal olarak kaydedin (bkz. Bölüm 4). Renk sensörü voltaj sinyali, sensöre bağlı bir DC amplifikatörü kullanılarak yükseltilebilir ( Şekil 4A ). Renk sensörünün, tadı vererek ve sensörün voltaj çıktısını kaydettirerek çalıştığından emin olun. Boya tarafından üretilen sinyal gürültü seviyesini aşmalıdır. Sinyali olabildiğince kareye yakın hale getirmek için sabit su akış oranını ayarlayın. Not: Birden fazla tat vericisini sırayla vererken, yeni deneme yanıcıya sahip ilk denemenin yeni ve önceki tat vericisinin bir karışımından oluşacağına dikkat edin. Bu nedenle, bu ilk denemeleri analiz etmedik. "> Şekil 4 : Tatlandırıcı Teslimat Sistemi. ( A ) Zamanlamalı atıştırmalık hayvanların burunlarına iletilmesi ve izlenmesi için kullanılan cihazın şeması. Sistemin ana bileşenleri kırmızı rakamlarla gösterilir. Damla suyunun sabit bir akışı, burun deliğinin bulunduğu yerdeki sert plastik boruya (1) silikon boru ile bağlanmış bir peristaltik pompa ile korundu (6). Az miktarda tat içermeyen boya içeren tatlar basınçlı 16 kanallı perfüzyon sistemi kullanılarak verilir. Tatları içeren rezervuarlar, burun deliğinin (5) yerleştirileceği deliğin üstündeki sert boruya tutturulmuş bir manifolda (2) bağlıdır. Pnömatik bir pompadan alınan sıkıştırılmış hava perfüzyon sistemine püskürtülür ve zamanlama özel yazılım ile kontrol edilir. birRenk sensörü (3), tat vericinin doğumunu izlemek için kullanılır. Sensör, burun deliğine bitişik rijit boruya ve tat yoğunluğu perfüzyon sisteminin çıkışının altına bağlanır. Renk sensörü voltaj sinyali bir DC amplifikatörü ile güçlendirilir. Amplifikatörün bitişiğindeki kırmızı iz, özel veri toplama yazılımı kullanılarak kaydedilen bir renk sinyalini gösterir; Sinyaldeki hızlı artış ve azalış, sırasıyla, tadının varış ve yıkamasını yansıtır. Güvenin burnu renk sensörünün hemen altında bulunan bir deliğe (5) yerleştirilir. Farklı hayvanların sarmallarının daima aynı yere yerleştirilmesini sağlamak için deliğin üzerine bir ağ (4) yerleştirilir. Sert tübün diğer tarafı, çıktıyı bir atık kabına (7) yönlendirmek için başka bir silikon tüpüne bağlanır. ( B ) Panel A'da gösterildiği gibi kırmızı sayılarla gösterilen sert plastik boruya bağlanan tat verici dağıtım sisteminin ana unsurlarını gösteren resim: suRenk sensörü (3), ağ (4) ve burun iletim hattının (5) tümü sert bir plastik boruya (1) bağlanan delik (6), kaynak sensörü (6) . ( C ) Manduca preparatının kuruluma yerleştirilmesi gösterilir. Güve burnu distal t2 / 3 sert plastik boru (1) deliğine (5) sokulur. İğne ile gösterildiği gibi burun diş mumu ve epoksi ile yerine sabitlenir. Rijit tüpün su girişi ve atık kabına çıkışı sırasıyla 6 ve 7 rakamları ile gösterilir. 2 sayısı, tastant manifold çıkış tüpünü gösterir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. 4. GRN'lerden Tastant Uyandıran Aktiviteyi İzlemek İçin Ekstraselüler Tetrode Kaydı Güve preparatını vibrasyonlu bir stereomikroskop altında platforma yerleştirinAtion İzolasyon Tablosu ( Şekil 4C ). Güvenin sağkalımının distal üçte ikisini tastant uygulama sisteminin sert tüpüne koyun ( Şekil 2B ). Bunu yapmak için, kelebeğin burnunu uzatın ve sonra yumuşak tüpün deliğine pansuman pensesi yardımı ile hafifçe iterek sokun. Sızıntıları önlemek için burun deliğini yumuşak diş mumu ve daha sonra epoksi bir kat ile sızdırmaz kılın ( Şekil 4C , giriş). Salin perfüzyon hattını baş kapsülüne bağlayın ve perfüzyon akışını 0.04 L / s'lik sabit bir hıza ayarlayın. Salin banyosuna bir toprak elektrotu ( yani, bir klorlu gümüş tel) sokun ( Şekil 5A ). 30'da açıklanan üretim prosedürünü takiben inşa edilmiş, ısmarlama bükülmüş tel tetrode kullanın (4 elektrot telinin, iyi izole edilmiş birimleri elde etmesi ve içine sığması önerilirsinir). Deneyden önce, 30'da açıklanan adımları izleyerek elektrotu elektroplama yapın. Tetroyu maksiller sinire yakın konumlandırmak için manuel mikromanipülatör kullanın. Sinir girmeye başlayıncaya kadar tetrode ilerletin ( Şekil 5 ). Kayda başlamadan önce sinirin içinde stabilize olmasını sağlamak için tetrode yerleştirdikten sonra en az 10 dakika bekleyin. Sinyali (3000x) genişletin ve 0,3-6 kHz arasında bir bant geçiren filtre kullanın. Veri toplama yazılımı kullanarak 40 kHz örnekleme hızında sinyal elde edin. Deney bittikten sonra güve preparatını dondurucuya yerleştirin. Şekil 5 : GRNlerden Tetrode Kaydı. ( A , büyük görüntü) Bir mikromanipulatör pGRNlerin aktivitesini kaydetmek için bükülmüş tel tetrode maksiller sinire (MxN) dantel. Bir klorür gümüş toprak elektrodu, gösterildiği gibi salin banyosuna yerleştirilir. ( A , inset) Maksiller sinirde tetrode gösteren beynin büyütülmüş bir görüntüsü. Alt ekzofageal bölge (SEZ) de endikedir. ( B ) A.'da olduğu gibi Manduca beyninin şematik görünümü. Bu rakamın daha büyük versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.