새로운 방식으로 맛보기 코딩 공부하기

주의 : Manduca 가 방출하는 미세한 분말 가루는 알레르기 성이 있으므로 실험실 안전 장갑과 안면 마스크를 사용하는 것이 좋습니다. 1. 만두 카 섹스타 (manduca sexta) 를 해부하여 상악 신경 및 특발성 신경 섬유 (SEZ)를 드러내십시오. 다음과 같은 특징에 따라 적절한 성을 선택하십시오 : 일반적인 건강한 외모 (날개는 완전히 펼쳐 져야하며 코와 코는 손상되지 않아야 함)로 부식 3 일 후. 나방을 개별적으로 플라스틱 컵에 넣어 운송하십시오. 나방을 폴리 프로필렌 튜브에 넣으십시오. 주의 : 나방의 가루가 퍼지는 것을 막기 위해 흄 후드에서이 단계를 수행하는 것이 좋습니다. 관은 나방의 몸체보다 약간 길어야합니다 ( 그림 1A ). 튜브는 15 mL 폴리 프로필렌 튜브를 절단하여 만들 수 있습니다. <li> 머리가 노출 될 때까지 나방을 밀고 나팔을 움직이지 않게 유지하는 데 도움이되도록 볼의 위로 다른 티슈 페이퍼를 삽입하십시오 ( 그림 1A ). 나방의 노출 된 머리 (복부 및 등)에서 가압 공기를 불어 넣어 머리카락을 제거하십시오. 에어 제트는 가압 공기 공급원에 주사기 (바늘이있는 1 mL, ID 약 1.4 mm, 날카로운 팁이 제거 된 상태)를 연결하여 만들 수 있습니다. 참고 : 머리카락을 제거한 후 흄 후드 외부에서 다음 단계를 모두 수행 할 수 있습니다. 대부분의 머리카락이 제거되면, 그림 1B 와 같이 머리의 등 부분이 위로 향하게하여 튜브를 고정 챔버에 넣으십시오 . 페트리 접시에 모델링 점토를 사용하여 길이 약 7cm, 높이 2.5cm의 삼각 기둥을 만듭니다 ( 그림 1B ). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> 그림 1 : Manduca 용 절개 챔버 준비. ( A ) 나방이 튜브에 묶여있다. 헤드는 한쪽 끝이 노출되어 있고 다른 끝은 티슈 페이퍼로 막혀 있습니다. ( B ) 페트리 접시 및 모델링 점토로 만든 해부 챔버가 표시됩니다. 머리의 등 부분이 위를 향하고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 안테나와 코를 보호하십시오. 면도날로 피펫 팁 (노란색 팁, 1-200 μL)을 절단하여 길이가 약 0.5 cm 인 3 개의 조각으로 3 개의 작은 튜브를 준비합니다. 안테나와 코가 안락하게 들어갈 수 있도록 내경이 충분히 커야합니다. 후크 준비하기와이어를 휘는 것 (22 AWG, 길이 약 7 cm). 나방의 코를 늘린 다음 튜브가 코의 근위 부분에 도달 할 때까지 와이어 훅으로 당겨서 작은 튜브 중 하나에 삽입합니다. 나방의 머리 캡슐 ( 그림 2A 왼쪽)의 등 부분에 딱딱한 바틱 왁스 (예 : 치과 용 전기 왁스를 사용하여 왁스를 녹여서 유도)로 작은 튜브를 고정시킵니다. 각 안테나를 튜브에 넣고 그림 2A (왼쪽)와 같이 바틱 왁스로 튜브를 고정합니다. 뜨거운 왁스로 안테나를 손상시키지 않도록주의하십시오. 두뇌의 전방 표면을 덮는 근육을 절단하여 움직임에 대해 뇌를 안정화시킵니다 ( 예 : 협측 압축기 근육). 해부 현미경에서, mak에 의해 머리 캡슐을 여는 이쑤시게에 붙인 면도날 칩으로 만든 마이크로 해부 가위 또는 미니 도끼를 사용하십시오( 그림 2A , 왼쪽 상단 삽 입). 마이크로 해부 가위를 사용하여 협측 압축기 근육을 자르십시오 (그림 25 참조). 근육이 쉽게 눈에 보이지 않기 때문에, 다음 행동 테스트는 근육이 잘렸다는 것을 확인하는 것이 좋습니다. 증류수로 자당을 희석하여 1M 용액을 얻는다. 피펫을 사용하여 약 200 μL의 자당 용액을 코의 원위부 2/3에 전달하고 5 분 동안 코를 관찰하십시오. 근육이 적절하게 절단되면 곤충은 코를 연장하거나 움직일 수 없어야합니다. 녹인 바틱 왁스의 레이어를 적용하여 헤드 캡슐의 입구를 밀봉합니다. 곤충을 뒤집어 머리 캡슐의 복부 쪽이 위를 향하게하십시오. 해부 절차 동안과 후에 식염수를 관류하는 것은 머리의 복부 쪽 주위에 왁스 컵을 구축전기 왁스 제거기 : 해부 현미경을 사용하여 머리 앞면을 따라 왁스의 첫 번째 줄을 뒤쪽으로 움직여 컵을 만들기 시작하십시오. 컵 안에 코와 관을 넣으십시오 ( 그림 2A 오른쪽). 눈의 높이에 도달 할 때까지 컵을 바깥쪽으로 그리고 위쪽으로 계속하십시오. 겸자를 사용하여 두개의 순측의 palps 중 하나를 취한 다음 옆면에 놓고 녹인 왁스를 추가하여 왁스 컵에 고정시킵니다. 다른 상악골 palp와 동일하게하십시오 ( 그림 2A 오른쪽). 왁스 컵과 튜브의 개구부를 봉하십시오. 참고 :이 단계에서는 에폭시가 사용되므로 왁스와 튜브의 틈새를 쉽게 봉인하고 안테나 및 코에 대한 열에 의한 손상을 방지 할 수 있습니다. 플라스틱 믹싱 접시에 이쑤시게를 사용하여 바이너리 에폭시를 섞으십시오. 혼합 접시를 보관하십시오. 얇은지를 적용하려면 이쑤시개를 사용하십시오.에폭시 층은 컵의 외부 및 내부에 위치한다 ( 도 2B ). 코와 관을 포함하는 튜브의 빈 공간을 에폭시로 채우고 목을 감싸고있는 폴리 프로필렌 튜브의 일부분을 충분한 에폭시로 채워 단단히 고정시킵니다 ( 그림 2B ). 약 20 분 동안 에폭시를 건조 상태로 두십시오. 이를 확인하려면 플라스틱 혼합 접시에 남아있는 에폭시를 테스트하여 단단하고 끈적 거리지 않게하십시오. Manduca 생리 식염수 28로 왁스 컵을 채우고 2 분간 누출이 없는지 확인하십시오. 누출이 보이는 경우 더 뜨거운 왁스 및 / 또는 에폭시를 도포하여 밀봉하십시오. 그림 2 : Manduca 준비 </em> 해부하십시오. ( A ) 길이 0.5cm 정도의 세 조각으로 잘라낸 피펫 팁으로 만든 작은 튜브 안에서 안테나와 코를 보호합니다. (왼쪽 패널, 큰 이미지) 튜브는 머리의 등 부분 주위에 적용된 녹인 바틱 왁스로 고정됩니다. (왼쪽 패널, 인 세트) 협측 압축기 근육을 제거하기 위해 큰 이미지의 점선으로 표시된대로 작은 컷을 만들어 헤드 캡의 등 쪽을 엽니 다. (오른쪽 패널) 왁스 컵은 해부 절차 및 기록 실험 중에 관류 한 생리 식염수의 저장소로 머리의 복부 측면을 둘러싸고 세워졌습니다. ( B ) 에폭시는 왁스 컵의 바닥과 머리의 등 부분 (왼쪽 패널) 사이 및 왁스와 안테나 및 코가있는 튜브 사이의 틈을 막기 위해 사용되며 튜브의 개구부를 포함하여 (오른쪽 패널 ). 여기를 클릭하십시오.o이 그림의 더 큰 버전보기. 해부 현미경, 순음 palps를 잘라 마이크로 해부 가위를 사용하십시오. 마이크로 해부 가위 또는 미니 도끼를 사용하여 머리 캡슐의 복부 쪽을여십시오. 네 개의 상처를 만듭니다. 앞면에서 앞면까지 각각의 눈을 감싸는 표피를 따라 2 번 자르고, 머리 뒤쪽을 따라 큐티클을 자르고, ( 그림 3A ) 머리 근처의 머리 앞쪽을 따라 큐티클을 하나 자른다. 부드럽게 두뇌를 노출 마이크로 해부 포셉을 사용하여 표피를 당겨. 두 날카로운 마이크로 해부 포셉을 천천히 조심스럽게 사용하여 지방 조직과 SEZ를 덮고있는 기관을 제거하십시오. 뇌나 신경 손상 (예 : 상악 신경, 시신경, 자궁 경부 연결)을 피하십시오. 생리 식염수를 자주 교체하여 뇌를 헹구고 시야를 개선하기 위해 자주 빛을 조절하십시오. 참고 : 이것은 di의 가장 중요한 부분 일 수 있습니다.단면; 그것은 실수로 상악 신경을 당기거나 부숴 서 쉽게 손상시킬 수 있습니다. 참고 :이 시점에서 SEZ와 상악 신경을 명확하게 볼 수 있어야합니다 ( 그림 3B -3C ). 그러나 뇌와 상악 신경은 얇은 칼집으로 덮여 있습니다. 칼집을 제거하려면 왁스 컵에있는 식염수를 식염수에 용해 된 10 % (w / v) 콜라게나 제 / 디스 파제로 교체하고 5 분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 염분으로 뇌를 여러 번 헹군 후 SEZ에서 상악 신경을 통해 외장을 당겨 초 미세 미세 절제 겸자로 외과를 부드럽게 제거합니다. 신선한 식염수로 왁스 컵을 관류하기 시작합니다. 생리 식 물줄기에서 추출한 튜브를 왁스 컵에 넣고 녹인 왁스로 고정하십시오. 무화과ure 3 : 만두 커 해부 절차. ( A ) 순측 방광판을 제거한 후, 점선으로 표시된대로 4 개의 상처를 만들어 헤드 캡슐을 연다. ( B ) 머리 캡슐을 열고 지방 조직과 기관을 제거한 후 뇌의 확대 된 이미지로 상악 신경 (MxN)과 식도 하부 영역 (SEZ, 뇌 아래의 뇌 영역을 지칭하는 용어)을 시각화 할 수 있습니다. 식도). 상악 신경은 코에있는 충치 수용체 뉴런 (GRNs)에서 SEZ로 축삭을 운반한다. ( C ) 만두 카 (Manduca) 뇌의 도식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 2. Tastant Delivery System 맛있는 전달 시스템은 4 가지 주요 요소로 구성됩니다 : 물 소스, 맛있는 다양체, 컬러 센서 및( 그림 4A- 4B ). 이 시스템을 구축하려면 그림 4B에 나와있는 단계를 따르십시오. 길이 약 6cm의 견고한 플라스틱 튜브를 사용하십시오 (ID 0.3cm). 코에 코를 배치 할 작은 구멍을 만들기 위해 납땜 인두를 사용하십시오 ( 그림 4A- 4B ). 다른 동물의 가축이 항상 같은 위치에 놓이게하려면 플라스틱 스크리닝 물질 (메시, 구멍 크기 약 0.1 cm)을 튜브에 연결하십시오 ( 그림 4A- 4B ). 면도날이나 회전 도구를 사용하여 강성 튜브를 코의 구멍에서 약 5 mm 정도 잘라냅니다. 튜브의 두 조각 사이에 메쉬를 놓습니다. 메쉬를 고정하고 튜브 외부에 에폭시를 적용하여 튜브를 다시 연결하십시오. 약 20 분 동안 에폭시를 건조 상태로 두십시오. 맛있는 전달의 경우 가압 된관류 시스템은 필요에 따라 많은 튜브를 갖추고 매니 폴드에 결합됩니다 (아래 참조). 납땜 인두를 사용하여 메쉬 위 약 1cm의 강체 튜브에 작은 구멍을 만드십시오. 관류 시스템 (ID 0.86 mm)에서 출력 튜브를 단단한 튜브에 삽입하고 에폭시를 적용하여 고정하십시오 ( 그림 4A -4B ). 연동 펌프를 사용하여 일정한 유량 (~ 40 mL / min)의 증류수를 공급하십시오. 실리콘 튜빙을 단단한 튜브에 연결하십시오 ( 그림 4A -4C ). 강성 튜브의 다른 쪽을 다른 실리콘 튜브에 연결하여 출력을 대형 폐기물 용기 ( 그림 4A-4C )로 보내십시오. 맛을 전달하기 위해, 재관류 시스템의 매니 폴드에 압축 공기를 주입하십시오. 이것은 예를 들어 시간에 따른 전압 펄스 입력에 의해 제어되는 공압 펌프 (10 psi)를 사용하여 매니 폴드에 압축 공기를 주입함으로써 달성 할 수 있습니다 d 튜브에 원하는 맛이 들어 있습니다. 1 초 펄스는 약 0.5 mL의 맛을냅니다. 3. 맛보기 준비 및 모니터링 Tastant Delivery 증류수에서 맛을 원하는 농도로 희석하십시오. 맛이 물줄기에 의해 더 희석 될 것이라는 점을 명심하십시오. 우리는 코에 도달하는 최종 농도를 초기 농도의 77 %로 측정했습니다 (참고 문헌 10 , 29 참조). 각자의 맛있는 용액에 인공 식품 염료를 첨가하여 맛이 가다랑어를 통과하는 정확한 타이밍을 결정하십시오. 우리는 0.05 % w / v의 녹색 염료 ( 물질 목록 참조)가 만두 카 GRNs를 활성화시키지 않는다는 것을 발견했습니다. 맛있는 용액에서 식품의 착색을 감지하려면 색상 센서 (표 1 참조)를 사용하십시오. 솔더링 아이언을 사용하여 메시에 인접한 구멍과 관류 시스템의 출력 튜브 아래 0.5cm의 구멍을 만듭니다 s = "xfig"> 그림 4A -4B). 센서를 단단한 튜브에 연결하고 거기에 에폭시를 바깥쪽에 붙입니다. 생체 신호와 함께 컬러 센서 전압 출력을 아날로그 신호로 기록하십시오 (섹션 4 참조). 컬러 센서 전압 신호는 센서에 연결된 DC 증폭기를 사용하여 증폭 될 수 있습니다 ( 그림 4A ). 맛을 전달하고 센서의 전압 출력을 기록하여 컬러 센서가 작동하는지 확인하십시오. 염료에 의해 추출 된 신호는 소음 수준을 초과해야합니다. 신호를 가능한 한 정사각형에 가깝게 유지하려면 일정한 유속을 조정하십시오. 참고 : 순서대로 여러 맛을 전 달하는 경우 새로운 맛을 가진 첫 번째 시도는 새 맛과 이전 맛을 혼합하여 이루어집니다. 이러한 이유로 우리는 이러한 첫 번째 시도를 분석하지 않았습니다. "> 그림 4 : Tastant Delivery System. ( A ) 동물의 코에 대한 맛을 측정 한 펄스를 전달하고 모니터링하는데 사용되는 장치의 개략도. 시스템의 주요 구성 요소는 빨간색 숫자로 표시됩니다. 경상의 플라스틱 튜브 (1)에 실리콘 튜빙으로 연결된 연동 식 펌프를 사용하여 코가 주시하는 곳에 일정한 양의 증류수가 유지됩니다 (1). 소량의 무염 염료를 함유 한 맛은 가압 16 채널 관류 시스템을 사용하여 전달됩니다. 미각을 포함하는 저장소는 코가 배치 될 구멍 위에 단단한 튜브에 부착 된 매니 폴드 (2)에 연결됩니다 (5). 공압 펌프의 압축 공기가 관류 시스템에 주입되어 사용자 정의 소프트웨어로 제어되는 타이밍으로 맛을 신속하게 전달합니다. 에이색상 센서 (3)는 맛있는 전달을 모니터하는 데 사용됩니다. 센서는 코에 인접하고 맛이있는 재관류 시스템의 출구 아래에있는 단단한 튜브에 연결됩니다. 컬러 센서 전압 신호는 DC 증폭기에 의해 증폭됩니다. 앰프에 인접한 인셋의 빨간색 트레이스는 맞춤형 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 기록 된 컬러 신호를 보여줍니다. 신호의 급격한 증가 및 감소는 각각 맛의 도착 및 씻김을 반영합니다. 나방의 주둥이는 컬러 센서 바로 아래에있는 구멍 (5)에 넣습니다. 메쉬 (4)는 다른 동물의 종아리가 항상 동일한 위치에 위치하도록 홀 위에 배치됩니다. 강체 튜브의 다른 쪽은 출력을 폐기물 컨테이너 (7)로 향하게하기 위해 다른 실리콘 튜브에 연결됩니다. ( B ) 단단한 플라스틱 튜브에 연결된 맛이 좋은 전달 시스템의 주요 요소를 보여주는 이미지로, 패널 A에 표시된 빨간색 숫자로 표시됩니다. 물(2), 컬러 센서 (3), 메시 (4) 및 코가 삽입 될 구멍 (5)은 모두 단단한 플라스틱 튜브 (1)에 연결되어 있습니다. . ( C ) 설치물에 Manduca 준비물을 배치했다. 나방 코의 선단 t2 / 3은 경질 플라스틱 튜브 (1)의 구멍 (5)으로 들어갑니다. 코는 치아 왁스와 에폭시로 고정되어 고정되어 있습니다. 강체 튜브로의 물의 유입량과 폐기물 용기로의 배출량은 각각 숫자 6과 7로 표시됩니다. 번호 2는 풍부한 매니 폴드 출력 튜빙을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 4. GRN에서 Tastant-evoked Activity를 모니터하기위한 세포 외 Tetrode 기록 진동에 입체 현미경으로 플랫폼 위에 나방 준비( 그림 4C ). 나방의 코의 원위 2/3를 맛이있는 전달 시스템의 단단한 튜브에 넣으십시오 ( 그림 2B ). 이렇게하려면, 나방의 코를 확장 한 다음 드레싱 포셉의 도움으로 가볍게 눌러서 강성 튜브의 구멍에 삽입하십시오. 코치를 연질 치아 왁스로 밀봉 한 다음 누출을 방지하기 위해 에폭시 층을 밀봉하십시오 ( 그림 4C , 입구). 염분 관류 라인을 머리 캡슐에 연결하고 관류 흐름을 약 0.04 L / h의 일정한 속도로 설정합니다. 접지 전극 (염화은 전선)을 식염수 욕조 ( 그림 5A )에 담그십시오. 30에 설명 된 제조 절차에 따라 제작 된 맞춤형 트위스트 와이어 테 트로 드를 사용하십시오 (4 개의 전극 와이어는 잘 격리 된 단위를 달성하고신경). 실험 전에 30에 설명 된 단계에 따라 전극을 전기 도금하십시오. 수동 microromanipulator를 사용하여 tetrode를 상악 신경 가까이에 배치하십시오. tetrode가 신경에 들어가기 시작할 때까지 전진하십시오 ( 그림 5 ). tetrode를 삽입 한 후 최소 10 분 동안 기다렸다가 녹음 전에 신경 내에서 안정되도록하십시오. 신호 (3000x)를 증폭하고 0.3-6 kHz 사이의 대역 통과 필터를 사용하십시오. 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 40 kHz 샘플링 속도로 신호를 수집하십시오. 실험을 마치면 나방 준비를 냉동실에 넣으십시오. 그림 5 : GRN에서 Tetrode 기록. ( A , 큰 이미지) micromanipulator는 pGRNs의 활동을 기록하기 위해 꼬인 철사 tetrode을 상악 신경 (MxN)에 레이스. 염화물 은색 접지 전극을 그림과 같이 염분 조에 놓습니다. ( A , 삽입) 상악 신경의 사극을 보여주는 뇌의 확대 된 이미지. 하부 식도 역 (SEZ)도 표시됩니다. ( B ) A에서와 같은 Manduca 두뇌의 도식 .이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.