فحص فحوصات لوصف رواية غشائي المنظمين المتورطين في الاستجابة الالتهابية
Summary
أحكام الضوابط البطانة الوعائية التوظيف الكريات البيض. ويساهم التسرب الكريات البيض غير كافية أمراض التهابات البشرية. ولذلك، تبحث عن رواية العناصر التنظيمية لتفعيل غشائي ضروري لتصميم تحسين العلاج لأمراض التهابات. وهنا يصف لنا منهجية شاملة لتوصيف المنظمين غشائي الرواية التي يمكن تعديلها الكريات البيض الاتجار أثناء التهاب.
Abstract
الطبقة غشائي أمر ضروري للحفاظ على التوازن في الجسم من خلال السيطرة على العديد من الوظائف المختلفة. تنظيم استجابة التهاب الطبقة غشائي أمر حاسم لمكافحة كفاءة المدخلات الضارة والمساعدة في إنعاش المناطق المتضررة. عندما تتعرض خلايا بطانية لبيئة تحريضية، مثل العنصر الخارجي لغشاء بكتيريا سلبية الغرام، lipopolysaccharide (LPS)، أنها التعبير عن السيتوكينات برو الملتهبة القابلة للذوبان، مثل Ccl5، Cxcl1، و Cxcl10، وتؤدي تفعيل تعميم الكريات البيضاء. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن التعبير عن جزيئات التصاق سيليكتين ه، VCAM-1 والمتكاملة-1 على سطح غشائي التفاعل والتصاق الكريات البيضاء تنشيط الطبقة غشائي، وفي نهاية المطاف التسرب نحو الأنسجة الملتهبة. في هذا السيناريو، الدالة غشائي يجب أحكام تنظيم لأن التنشيط المفرط أو عيب في تجنيد الكريات البيض يمكن أن تؤدي إلى الاضطرابات المتصلة بالتهابات. نظراً للعديد من هذه الاضطرابات لم يكن علاج فعال، يجب التحقيق في استراتيجيات جديدة مع تركيز على طبقة الأوعية الدموية. ونحن نقترح فحوصات شاملة مفيدة للبحث عن المنظمين غشائي الرواية التي تعدل وظيفة الكريات البيض. نحن نحلل غشائي التنشيط باستخدام تعبير محددة الأهداف المتورطين في تجنيد الكريات البيض (مثل، السيتوكينات، المستقطبات، وجزيئات الالتصاق) مع العديد من التقنيات، بما في ذلك: (سلسلة من ردود الفعل بوليميريز الكمية في الوقت الحقيقي رتقبكر)، ووصمة عار الغربية، تدفق فحوصات الخلوي والالتصاق. تحديد وظيفة غشائي في سياق التهاب هذه النهج وهي مفيدة جداً لإجراء فحوصات الكشف لتوصيف المنظمين التهاب غشائي الرواية التي يحتمل أن تكون قيماً لتصميم استراتيجيات علاجية جديدة.
Introduction
الالتهاب استجابة بيولوجية مفيدة ضد العوامل المعدية, مع الهدف الرئيسي للقضاء على مسببات المرض وإصلاح الأنسجة التالفة. تحت ظروف معينة، مثل الالتهابات المزمنة أو أمراض المناعة الذاتية، لا حل التهاب. بدلاً من ذلك، هناك فعل شاذة مع استمرار تسلل الكريات البيضاء، أدى استجابة مناعية مطول الذي يؤدي إلى تلف الأنسجة، التليف، وفقدان الوظيفة، وعموما، والعجز، وفي بعض الحالات وفاة المريض. هذه الاضطرابات البشرية، نشرة مصورة كأمراض التهابات، كلها تنطوي على الأوعية الدموية للسيطرة على التسرب الكريات البيض1،2.
خلايا بطانية تلعب دوراً أساسيا في تنظيم الاستجابة الالتهابية بمراقبة الاتجار الكريات البيض. عندما يتعرض الطبقة البطانية لوسطاء التهابات مثل لبس، البطانة يستريح ينشط وتعرب عن السيتوكينات الموالية التحريضية (Cxcl10، Cxcl5، Cxcl1، إلخ) وجزيئات الالتصاق (سيليكتين ه، VCAM-1 والمتكاملة-1) أن صالح التجنيد لتعميم الكريات البيضاء إلى موقع العدوى. الكريات البيضاء أعدادا من السيتوكينات أطلق سراحهم ثم التوسط المتداول والتفاعل مع الطبقة غشائي من خلال النظراء لاصقة مراسل: بسجل-1 إلى سيليكتين إنتغرين α4β1 VCAM-1 و αLβ2 إنتغرين المتكاملة-1. أخيرا، الكريات البيضاء ترحيل عبر المفرج نحو تركيز التهاب3.
قد تجلى الدور الأساسي الذي تؤديه البطانة في تنظيم الاستجابة الالتهابية في الفئران التي تم تعديلها وراثيا للتعبير عن مستقبلات لبس، مثل عدد القتلى مستقبلات 4 (TLR4)، فقط في خلايا بطانية. كانت هذه الحيوانات غشائي TLR4 قادرة على الاستجابة لالتهاب بوساطة لبس والكشف عن العدوى التي تم إنشاؤها بعد تلقيح البكتيريا، وتحقيق وبناء على ذلك القرار العدوى وبقاء مستويات مماثلة ك الفئران البرية نوع4 , 5.
لمسار البطانة-وينظم الاستجابة الالتهابية، قد تم افترض أن تثبيط التفاعل البطانة الكريات البيض في بعض المراحل سيؤدي إلى الحد من الهجرة عبر-غشائي وتنبؤ أفضل الأمراض المرتبطة بالالتهابات. في الواقع، قد صممت عدة استراتيجيات تستهدف التفاعل التنشيط والكريات البيض-البطانة غشائي تعوق التسرب خلايا المناعية لعلاج أمراض التهابات6،7.
وفي هذا التقرير، يصف لنا مجموعة شاملة من تقنيات في المختبر لتوصيف كامل النشاط غشائي ردا على لبس التحفيز التحريضية ودورها في تنشيط الكريات البيض والانضمام إلى طبقة الأوعية الدموية. نموذج غشائي الخلايا المستخدمة في هذه المخطوطة كان خط الخلية غشائي الرئة الماوس (القانون النموذجي-04)، كما وصفها هورتيلانو et al. 8-تم التحقق من خط الخلية القانون النموذجي-04 في الأدب أن يكون نظاما مناسباً لدراسة تفعيل غشائي9،10. استناداً إلى الاهتمامات البحثية، هذه النهج يمكن أن تكون بسهولة استقراء أي بطانية أو نظم الكريات البيض والشخصية المثيرة. حالما يتم تعريف المعلمات غشائي في الشروط المحددة، يمكن اختبار النظام أدوية جديدة في التجربة المقترحة لتقييم تنشيط الأوعية الدموية. وفي هذا السياق التحريضية، خلايا البطانة اختبارها مع مجمع الفائدة يمكن مقارنتها بشروط مراقبة الخلايا، وأي الفروق الناتجة عن ذلك يجوز إبلاغ نتائج تشخيصية للمخدرات على التنمية والتقدم من التهاب. في الختام، نحن نقترح نظام ذات صلة لتوصيف الأهداف المخدرات الجديدة إلى خلايا بطانية، التي يمكن أن تؤثر في تصميم رواية العلاجات الخاصة بالأوعية الدموية ضد الأمراض المرتبطة بالالتهابات.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف هذا البروتوكول غشائي تكنولوجيا التدرجي الذي يرسي الأساس لاستكشاف الآليات الرواية التي تشارك في تنظيم الاستجابة الالتهابية. تستند إلى دراسة النشاط غشائي تحفزها لبس هذه النهج وتقييم الخطوات الحاسمة التي تشارك في تجنيد الكريات البيض خلال الاستجابة الالتهابية، على وجه التحديد: إطلاق ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيده هذا العمل y وزارة الاقتصاد دي كومبيتيتيفيداد (مينيكو) ومعهد الصحة كارلوس الثالث (إيسسييي) (منحة رقم 1149/16 إييربي للجامعة؛ مبي 1410/09 إلى س. هورتيلانو)؛ قبل مينيكو عن طريق أون فوندو لبحوث الصحة (الجبهة الإسلامية للإنقاذ) (المنح الأرقام PI11.0036 و PI14.0055 إلى هورتيلانو س.). وأيد هيرانز س. إييربي 1149/16 من إيسسييي.
Materials
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/ml |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/ml |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/ml |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/ml |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/ml |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/ml |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/ml |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/ml |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/ml |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/ml |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10000 |
References
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation?. Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
- Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
- Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
- McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
- Chamorro, &. #. 1. 9. 3. ;., Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
- Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
- Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
- Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
- . SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013)
- Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- . Pierce BCA Protein Assay Kit Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017)
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
- . ImageJ User Guide Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017)
- Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930 (2015).
- Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Tedgui, A., Mallat, Z. Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall. Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).
- Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
- Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149 (2014).
- Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
- Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).
