通过显微注射卵母细胞生成转基因小鼠

在脊椎动物和无脊椎动物中的动物模型已经有助于检查人类病情如阿尔茨海默病^1,2的病理生理学。他们也是寻找疾病修饰剂的最宝贵的工具，并最终开发出新的治疗策略，希望得到治愈。虽然每个模型都有固有的局限性，但是使用动物作为整个系统模型对于生物医学研究至关重要。这是因为组织培养不能完全模拟代谢和复杂的生理环境。

迄今为止，鼠标仍然是用于遗传操作的最常见的哺乳动物物种，因为它具有几个优点。与疾病相关的生理过程和基因在小鼠和人之间是高度保守的。小鼠是第一个拥有全基因组测序的哺乳动物（2002年），人类基因组前一年我（2003）。除了丰富的遗传信息，小鼠具有良好的育种能力，快速的开发周期（从受精到断奶6周）和合理的大小。所有这些优点，加上生理指标，如独特的外套颜色（交叉策略所需），使得鼠标成为遗传操作的有吸引力的模型。值得注意的是，在现代遗传学的很早的时代，格雷戈尔·门德尔（Gregor Mendel）开始对老鼠进行植物移植³ 。

基因转移技术导致在三十年前第一代转基因小鼠的产生⁴ ，最初使用病毒递送。然而，研究人员很快意识到，小鼠转基因的主要挑战之一是无法控制外源DNA的命运。因为转基因向小鼠卵母细胞的病毒递送导致随机地整合到基因组中的多个拷贝，这是可能的建立后续转基因株系的限制。

当Gordon 等人通过显微注射产生第一个转基因小鼠系列^5,6 。这开始了重组DNA技术的时代，影响显微注射结局的参数已被广泛研究⁷ 。虽然显微注射不允许控制转基因的整合位点（最终导致每个创始人小鼠的特异性表达水平），但是原核显微注射的主要优点仍然是形成连续体（ 即，转基因的多个拷贝的阵列，在基因组整合前^5） 。多年来已经使用这种特征来建立数千个过表达感兴趣的基因的转基因小鼠品系。从那时起，转基因，a生物体基因组的人工修饰已广泛用于鉴定单一基因在疾病发生中的作用。

当马里奥·卡佩奇奇成功地破坏了小鼠中的单个基因时，达到了操纵小鼠基因组的另一个关键成果，打开了基因靶向时代⁸ 。然而，基于ES细胞的基因靶向快速出现主要缺点，包括培养ES细胞的挑战，嵌合体的程度有所不同，以及进程的长度（ 即 12-18个月，最小化获得小鼠） 。

最近，已经出现了诸如工程内切核酸酶（ 例如锌指核酸酶（ZFN），转录激活物样效应核酸酶（TALEN））和聚集的定期交织的短回文重复序列（CRISPR / Cas9）的新技术的进展，作为替代方法加速麦克风中基因靶向过程e ^9，10 。这些核酸内切酶可以通过显微注射容易地注入小鼠卵母细胞，从而在短短6周内产生基因靶向的小鼠。

自从关于使用CRISPR进行基因组编辑的第一份报告¹¹以来，这种细菌适应性免疫系统由于具有许多优点而取代了ZFN和TALEN，包括易于合成和一次靶向多个基因座的能力（简称“复用” “）。 CRISPR首先用于小鼠¹²中的基因靶向，并已被应用于从植物到人类的无数种类^13,14 。迄今为止，还没有关于抗CRISPR基因组编辑的单一物种的报道。

产生转基因小鼠的两个主要限制步骤是注射卵母细胞和再植入的这些卵母细胞变成假怀孕的雌性。尽管我们已经描述了这种技术¹⁵和其他¹⁶ ，但是近来在小鼠胚胎学和基因转移技术方面的技术改进已经改变了生产转基因小鼠的过程。这里将描述这些改进。