Генерация генетически модифицированных мышей посредством микроинъекции ооцитов

Модели животных, как у позвоночных, так и у беспозвоночных, сыграли важную роль в изучении патофизиологии состояний человека, таких как болезнь Альцгеймера ^{1 , 2} . Они также являются бесценными инструментами для поиска модификаторов болезни и в конечном итоге разрабатывают новые стратегии лечения в надежде на лечение. Хотя каждая модель имеет внутренние ограничения, использование животных как целых системных моделей жизненно важно для биомедицинских исследований. Это связано с тем, что метаболическая и сложная физиологическая среда не может быть полностью смоделирована в культуре тканей.

На сегодняшний день мышь остается наиболее распространенным видом млекопитающих, используемым для генетической манипуляции, поскольку она имеет несколько преимуществ. Физиологические процессы и гены, связанные с заболеваниями, очень сохраняются между мышами и людьми. Мышь была первым млекопитающим, имеющим полный геном, секвенированный (2002), за год до генома человекаМеня (2003). Помимо этого богатства генетической информации мышь обладает хорошей способностью к размножению, быстрым циклом развития (6 недель от оплодотворения до отлучения) и разумным размером. Все эти преимущества в сочетании с физиологическими показателями, такими как различные цвета пальто (необходимые для перекрестных стратегий), сделали мышь привлекательной моделью для генетических манипуляций. Примечательно, что в самом раннем возрасте современной генетики Грегор Мендель начал работать над мышами, прежде чем переходить на растения ³ .

Методы переноса гена привели к генерации первой трансгенной мыши в течение трех десятилетий назад ⁴ , первоначально созданной с использованием вирусной доставки. Однако вскоре исследователи поняли, что одной из основных проблем трансгенеза мыши является невозможность контролировать судьбу экзогенной ДНК. Поскольку вирусная доставка трансгенов в ооциты мыши приводила к множественным копиям, случайным образом интегрированным в геном, возможноY установления последующих трансгенных линий было ограничено.

Одно из таких ограничений было преодолено, когда Гордон и др. Генерировали первую трансгенную линию мыши путем микроинъекции ^{5 , 6} . Это начало эры технологии рекомбинантной ДНК, и параметры, влияющие на результат сеанса микроинъекции, были широко изучены ⁷ . Хотя микроинъекция не позволяет контролировать сайт интеграции трансгена (что в конечном итоге приводит к определенным уровням экспрессии для каждой мыши-основателя), основным преимуществом пронуклеарного микроинъекции остается образование конкатемеров ( т. Е. Массивов множественных копий трансгена, Связанные последовательно) до геномной интеграции ⁵ . Эта характеристика использовалась на протяжении многих лет, чтобы установить тысячи трансгенных линий мыши, которые сверхэкспрессируют ген, представляющий интерес. С тех пор трансгенезис, aRtificial модификация генома организма, широко используется для определения роли одиночных генов в возникновении заболеваний.

Еще одно ключевое достижение в манипуляции с геномом мыши было достигнуто, когда Марио Капечи успешно разрушил один ген мыши, открыв эру нацеливания гена ⁸ . Тем не менее, основные недостатки быстро возникали из нацеленного на ЭС клеточного гена, включая проблемы культивирования ES-клеток, несколько изменчивую степень химеризма и длину процесса ( т. Е. 12-18 месяцев, минимум, чтобы получить мышь) ,

Недавно появились новые технологии, такие как инженерные эндонуклеазы ( например, нуклеазы цинковых пальцев (ZFN), активатор-подобные эффекторные нуклеазы транскрипции (TALEN) и кластеризованные регулярно промежуточные короткие палиндромные повторы (CRISPR / Cas9)), как альтернативные методы Ускорить процесс нацеливания генов в микрофонE ^{9 , 10} . Эти эндонуклеазы могут быть легко введены в ооциты мыши путем микроинъекции, что позволяет генерировать ген-целевых мышей всего за 6 недель.

Начиная с первого отчета об использовании CRISPR для редактирования генома ¹¹ , эта бактериальная адаптивная иммунная система заменила ZFN и TALEN из-за ее многочисленных преимуществ, в том числе легкости синтеза и способности сразу нацеливать несколько локусов (называемых «мультиплексированием» «). CRISPR был впервые использован для нацеливания генов у мышей ¹² и с тех пор применяется к бесчисленным видам, от растений до людей ^{13 , 14} . На сегодняшний день нет отчета об одном виде, устойчивом к редактированию генома CRISPR.

Двумя основными предельными стадиями генерации трансгенных мышей являются инъекция ооцитов и реимплантацияИз этих ооцитов в псевдо-беременных женщин. Хотя эта методика была описана нами ¹⁵ и другими ¹⁶ , последние технические усовершенствования эмбриологии мыши и методов переноса генов коренным образом изменили процесс генерации генетически модифицированных мышей. Эти улучшения будут описаны здесь.