Generatie van genetisch gemodificeerde muizen via de microinjectie van oocyten

Diermodellen, zowel bij gewervelde dieren als in ongewervelden, hebben bijgedragen tot het onderzoek naar de pathofysiologie van menselijke aandoeningen, zoals de ziekte van Alzheimer ^{1 , 2} . Ze zijn ook waardevolle hulpmiddelen om te zoeken naar ziekteveranderende middelen en uiteindelijk nieuwe behandelstrategieën te ontwikkelen in de hoop op een genezing. Hoewel elk model intrinsieke beperkingen heeft, is het gebruik van dieren als gehele systemische modellen van vitaal belang voor biomedisch onderzoek. Dit komt doordat de metabolische en complexe fysiologische omgeving niet volledig in de weefselkweek kan worden gesimuleerd.

Tot op heden blijft de muis de meest voorkomende zoogdiersoort die wordt gebruikt voor genetische manipulatie omdat het meerdere voordelen heeft. De fysiologische processen en genen die verband houden met ziekten worden sterk bewaard tussen muizen en mensen. De muis was het eerste zoogdier om zijn volledige genoom sequenced (2002) te hebben, een jaar voor het menselijk genoMij ​​(2003). Naast deze rijkdom genetische informatie heeft de muis goede fokcapaciteiten, een snelle ontwikkelcyclus (6 weken van bevruchting tot speen) en een redelijke omvang. Al deze voordelen, in combinatie met fysiologische indicatoren, zoals onderscheidende coat kleuren (vereist voor het oversteken van strategieën), maakte de muis een aantrekkelijk model voor genetische manipulatie. Met name in de vroege tijd van de moderne genetica begon Gregor Mendel met muizen te werken voordat ze naar planten ^{3 gaan} .

Gene transfer technieken resulteerden in de generatie van de eerste transgene muis over drie decennia geleden ⁴ , oorspronkelijk gemaakt met behulp van virale levering. Echter, onderzoekers realiseerden snel dat een van de belangrijkste uitdagingen van de muis transgenese het onvermogen was om het lot van het exogene DNA te controleren. Omdat de virale afgifte van transgenen in muis-oocyten resulteerde in meerdere kopieën willekeurig geïntegreerd in het genoom, de mogelijkheidY van het opstellen van de volgende transgene lijnen was beperkt.

Een dergelijke beperking werd overwonnen toen Gordon et al. Genereerde de eerste transgene muislijn door microinjectie ^{5 , 6} . Dit begon het tijdperk van recombinante DNA technologie, en de parameters die het resultaat van een microinjectiesessie beïnvloeden zijn in grote mate bestudeerd ⁷ . Hoewel microinjectie geen controle biedt op de integratieplaats van het transgeen (dat uiteindelijk resulteert in specifieke expressieniveaus voor elke oprichtermuis), blijft het voornaamste voordeel van pronucleaire microinjectie de vorming van concatemers ( dat wil zeggen arrays van meerdere kopieën van het transgene, Gekoppeld in serie) voor genomische integratie ⁵ . Dit kenmerk is door de jaren heen gebruikt om duizenden transgene muislijnen te vormen die een gen van belang uitdrukken. Sindsdien is transgenese, de aRtmatige modificatie van het genoom van een organisme, is uitgebreid gebruikt om de rol van enkele genen bij het optreden van ziekten te identificeren.

Een verdere belangrijke prestatie bij het manipuleren van het muisgenoom werd bereikt toen Mario Capecchi succesvol een enkel gen in de muis ontwricht, waardoor het tijdperk van gen targeting ^{8 werd} geopend. Echter, grote nadeel kwam snel uit ES-cel gebaseerde gen targeting, met inbegrip van de uitdagingen van het cultiveren van ES cellen, de ietwat variabele mate van chimerisme en de lengte van het proces ( dat wil zeggen 12-18 maanden, minimum, om de muis te verkrijgen) .

Onlangs zijn vooruitgang geboekt in nieuwe technologieën, zoals geanimeerde endonucleasen (bijvoorbeeld zinkvinger nucleasen (ZFN), transcriptie activator-achtige effector nucleasen (TALEN) en clusterde regelmatige interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR / Cas9)) Versnellen het proces van gen targeting in micE ^{9 , 10} . Deze endonucleasen kunnen gemakkelijk worden geïnjecteerd in muis-oocyten door microinjectie, waardoor de generatie van gen-gerichte muizen in zo weinig als 6 weken mogelijk wordt.

Sinds het eerste rapport over het gebruik van CRISPR voor genoombewerking ¹¹ , heeft dit bacteriële adaptieve immuunsysteem ZFN en TALEN vervangen door zijn vele voordelen, waaronder het gemak van de synthese en het vermogen om meerdere loci tegelijk te richten (aangeduid als "multiplexing "). CRISPR werd voor het eerst gebruikt voor gen targeting in muizen ¹² en is sindsdien toegepast op ontelbare soorten, van planten tot mensen ^{13 , 14} . Tot op heden is er geen rapport van een enkele soort resistent tegen CRISPR genoom bewerking.

De twee hoofdbeperkende stappen van de generatie transgene muizen zijn de injectie van oocyten en de reimplantatieVan deze oocyten in pseudo-zwangere vrouwtjes. Hoewel deze techniek is beschreven door ons ¹⁵ en anderen ¹⁶ , hebben de recente technische verbeteringen in de muisembryologie en genoverdrachtstechnieken het proces om genetisch gemodificeerde muizen te generen, omgezet. Deze verbeteringen zullen hierin beschreven worden.