JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
유전학

Studie af Cyklusreguleret Gen Expression af To Komplementære Celle Synkronisering Protokoller

Published: June 06, 2017
doi:
10.3791/55745
, ,
1Department of Cell Biology and Histology,University of the Basque Country, UPV/EHU, 2Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology,University of the Basque Country, UPV/EHU, 3Department of Molecular Mechanisms of Disease,University of Zurich

Summary

Vi rapporterer to cellesynkroniseringsprotokoller, der giver en sammenhæng til at studere begivenheder relateret til specifikke faser af cellecyklussen. Vi viser, at denne tilgang er nyttig til analyse af reguleringen af ​​specifikke gener i en upertureret cellecyklus eller ved udsættelse for midler, som påvirker cellecyklussen.

Abstract

Gencyklusprogrammet for cellecyklussen repræsenterer et kritisk trin for forståelse af cellecyklusafhængige processer og deres rolle i sygdomme som kræft. Cellecyklusreguleret genekspression analyse afhænger af cellesynkronisering i specifikke faser. Her beskriver vi en metode, der benytter to komplementære synkroniseringsprotokoller, der almindeligvis anvendes til at studere periodisk variation af genekspression under cellecyklussen. Begge procedurer er baseret på forbigående blokering af cellecyklussen i et bestemt punkt. Synkroniseringsprotokollen ved hydroxyurea (HU) -behandling fører til cellulær arrest i sen G1 / tidlig S-fase, og frigivelse fra HU-medieret arrestation giver en cellulær population ensartet fremgang gennem S og G2 / M. Synkroniseringsprotokollen ved thymidin og nocodazol (Thy-Noc) -behandling blokerer celler i tidlig mitose, og frigivelse fra Thy-Noc-medieret arrest tilvejebringer en synkroniseret cellulær population egnet til G1-fase og S-fase-enPrøv studier. Anvendelse af begge procedurer kræver overvågning af cellecyklusfordelingsprofilerne, som typisk udføres efter propidiumiodid (PI) farvning af cellerne og flowcytometri-medieret analyse af DNA-indhold. Vi viser, at den kombinerede anvendelse af to synkroniseringsprotokoller er en robust tilgang til klart at bestemme transkriptionsprofilerne for gener, som er differentielt reguleret i cellecyklussen ( dvs. E2F1 og E2F7) og følgelig at have en bedre forståelse af deres rolle i cellecyklus processer. Desuden viser vi, at denne tilgang er nyttig til undersøgelse af mekanismer, der ligger til grund for lægemiddelbaserede terapier ( dvs. mitomycin C, et anticancermiddel), fordi det gør det muligt at diskriminere gener, der reagerer på det genotoksiske middel fra dem, der udelukkende er påvirket af cellecyklussystemforstyrrelser Pålagt af agenten.

Introduction

Overgang gennem alle faser af cellecyklussen er koblet til et tæt reguleret genekspressionsprogram. Denne koordinerede "on og off" -genskription gennem hele cellecyklussen antages at være under kontrol af komplekse transkriptionsregulatorsystemer, der regulerer ikke blot timingen, men også niveauerne af genekspression. Deregulering af nøglecellecykluskomponenter er kendt for at bidrage til udviklingen af ​​flere sygdomme og er et veletableret kendetegn for tumorigenese 1 , 2 . Gennemgående transskriptomiske analyser udført i gær- og pattedyrsceller har vist, at et stort antal gener udviser periodiske genekspressionsmønstre i cellecyklussen, hvilket tyder på, at transkriptionelle udsving under cellecyklussen er en afspejling af det tidsmæssige krav for et givet genprodukt I en præcis fase 3 , 4 , </suP> 5 .

En vigtig opgave i undersøgelsen af ​​cellecyklusreguleret genekspression er synkroniseringen af ​​celler i specifikke cellecyklusfaser. Cellesynkronisering hjælper med at fortolke forening af et genekspressionsmønster til en bestemt cellecyklusfaseovergang, og det har ført til en bedre forståelse af reguleringen og funktionen af ​​adskillige gener. Cellesynkronisering er også vigtig for at studere virkningsmekanismen for anticancer-lægemidler, da kemoterapeutiske midler er kendt for at påvirke både genekspression såvel som cellecykluskinetik 6 , 7 . Ikke desto mindre er det ofte svært at afgøre, om genekspressionskomplikationer som følge af behandling med disse midler er et direkte respons på behandlingen eller blot er konsekvensen af ​​ændringer i cellecyklusprofiler. For at skelne mellem disse muligheder bør genekspression analyseres i celler, der har været sYnkroniseret forud for tilsætning af det kemoterapeutiske lægemiddel.

Med undtagelse af nogle primære celler, såsom frisk isolerede lymfoide celler – som udgør en homogen cellepopulation synkroniseret i G08 – vokser in vitro etablerede cellelinier asynkront i kultur. Under regelmæssige vækstbetingelser findes disse asynkrone cykelceller i alle faser af cellecyklussen, men fortrinsvis i G1 9 . Derfor tilvejebringer denne sammenhæng ikke et optimalt scenario for funktionelle eller genekspression analyser i en specifik cellecyklus fase ( fx G1, S etc.). Ikke-transformerede immortaliserede cellelinier ( fx fibroblaster) kan synkroniseres med såkaldte fysiologiske metoder 10 . Disse fremgangsmåder er baseret på de tilbageholdte primære celleegenskaber af ikke-transformerede celler, såsom cellekontaktinhibering og vækstfaktorafhængighed for at fortsætte cyklering. FjernelseAf serum i kombination med kontaktinhibering gør ikke-transformerede celler arresteret ved G0 / G1. Imidlertid kræver synkroniseret cellecyklusindgang og -progression ofte subkultur, hvilket også involverer kunstig frigørelse af cellerne og genplacering 10 . Vigtigst er denne metode ikke egnet til synkronisering af transformerede cellelinjer, det store flertal af etablerede cellelinier, som i øjeblikket er i brug, karakteriseret ved manglende cellekontakt-medieret væksthæmning eller respons på vækstfaktorudtagning. Det er således klart, at alternative metoder er nødvendige for effektiv cellesynkronisering i specifikke faser af cellecyklussen. Generelt er de mest anvendte synkroniseringsmetoder baseret på forbigående kemisk eller farmakologisk inhibering af et defineret punkt i cellecyklussen, typisk DNA-syntese eller mitotisk spindeldannelse. Inhibering af DNA-syntese synkroniserer celler ved at arrestere dem i sen G1 eller tidlig S-fase. Dette kan være achiVed hjælp af tilsætningen af ​​forbindelser som mimosin, en inhibitor af nukleotidbiosyntese 11 , 12 , aphidicolin, en inhibitor af DNA-polymeraser 13 , 14 , hydroxyurea, en inhibitor af ribonukleotidreduktase 15 , 16 eller ved overskydende mængder af thymidin 17 , 18 . På den anden side er inhibitorer af mikrotubulapolymerisation, såsom colchicin eller nocodazol, i stand til at blokere mitotisk spindeldannelse, der fører til cellesynkronisering ved tidlig M-fase 19 , 20 , 21 .

I dette værk beskriver vi en metode, der involverer to komplementære synkroniseringsprotokoller baseret på forbigående kemisk inhibering til undersøgelse af ekspressionen af ​​cellecyklusregulerede gener ved mRNA'etniveau. Denne metode er grundlæggende for at definere cellecyklusgenernes rolle i specifikke cellecyklusprocesser. Desuden tilvejebringer den en generel ramme til undersøgelse af virkningen af ​​anticancerbehandlinger for nøjagtigt at detektere lægemiddelresponsive gener og for at minimere misfortolkninger afledt af forstyrrelser i cellecyklusprogression genereret af disse lægemidler.

Protocol

1. Cellulær synkronisering, frigivelse og overvågning af cellecyklusprogression Thymidin- og nocodazolbaseret (Thy-Noc) -synkronisering og frigivelse af U2OS-celler fra myosit Forbered det krævede cellekulturmedium. U2OS-celler dyrkes rutinemæssigt i DMEM-Glutamin-medium komplementeret med 10% (vol / vol) FBS (valgfrit: 1% penicillin / streptomycin). Udfør alt medium forberedelse og manipulation under sterile forhold og opvarmning komplementeret medium (fra nu af kaldt "kom…

Representative Results

Skematisk repræsentation af Thy-Noc og HU-baserede protokoller til cellesynkronisering. Figur 1 opsummerer de trin, der kræves for U2OS-cellesynkronisering og efterfølgende prøveopsamling for at verificere progression gennem cellecyklussen og for at udføre genekspression analyser. Phospho-H3 og PI-farvning er gode evalueringsparametre til at vælge s…

Discussion

Analyse af finjusterede regulerede gener involveret i forbigående og specifikke roller i cellecyklussen kræver en ensartet cellepopulation. Mange forskere bruger rutinemæssigt langvarige tumorcellelinjer til disse formål, og der er udviklet en række metoder for at opnå synkroniserede (eller delvis synkrone) cellepopulationer med det formål at samle så mange celler som muligt i definerede cellecyklusfaser. Desuden er der gjort en stor indsats for at forbedre og optimere veletablerede synkroniseringsmetoder. Ikke …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker medlemmerne af Zubiaga og Altmeyer laboratorierne for nyttige diskussioner og teknisk support. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra det spanske ministerium (SAF2015-67562-R, MINECO / FEDER, UE), den baskiske regering (IT634-13 og KK-2015/89) og universitetet i Baskerlandet UPV / EHU UFI11 / 20).

Materials

DMEM, high glucose, GutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 61965-059
FBS, qualified, E.U.-approved, South America origin Thermo Fisher Scientific 10270-106
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
0.25% Trypsin-EDTA (1X), phenol red Thermo Fisher Scientific 25200-072
Thymidine SIGMA T1895-5G Freshly prepared. Slight warming might help dissolve thymidine.
Nocodazole SIGMA M-1404 Stock solution in DMSO stored at -20 ºC in small aliquots
Hydroxyurea SIGMA H8627 Freshly prepared
Mitomycin C from Streptomyces caespitosus SIGMA M4287 1.5mM stock solution in sterile H2O protected from light and stored at 4ºC
Dimethyl sulfoxide SIGMA D2650
Propidium iodide SIGMA P4170 Stock solution in sterile PBS at 5 mg/ml, stored at 4º C protected from light.
PBS pH 7.6 Home made
Ethanol PANREAC A3678,2500
Chloroform SIGMA C2432
Sodium Citrate PANREAC 131655
Triton X-100 SIGMA T8787
RNAse A Thermo Fisher Scientific EN0531
TRIzol Reagent LifeTechnologies 15596018
RNeasy Mini kit QIAGEN 74106
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific 4368814
Anti-Cyclin E1 antibody Cell Signaling 4129 1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC
Anti-Cyclin B1 antibody Cell Signaling 4135 1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC
Anti-β-actin SIGMA A-5441 1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT
Anti-pH3 (Ser 10) antiboty Millipore 06-570 Specified in the protocol
Secondary anti-rabbit AlexaFluor 488 antibody Invitrogen R37116 Specified in the protocol
Secondary anti-mouse-HRP antibody Santa Cruz Biotechnology sc-3697 1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT
Forward E2F1 antibody (human)                    TGACATCACCAACGTCCTTGA Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse E2F1 antibody (human)                    CTGTGCGAGGTCCTGGGTC Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward E2F7 antibody (human)                    GGAAAGGCAACAGCAAACTCT Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse E2F7 antibody (human)                    TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGA Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward p21Cip1 antibody (human)                    AGCAGAGGAAGACCATGTGGAC Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse p21Cip1 antibody (human)                    TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAG Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward TBP antibody (human) reference gene                     Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse TBP antibody (human)                     Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward Oxa1L antibody (human) reference gene   CACTTGCCAGAGATCCAGAAG                  Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse Oxa1L  antibody (human)    CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG                 Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Power SYBRGreen PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4368702
FACS Tubes  Sarstedt 551578
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific N8010560
Corning 100mm TC-Treated Culture Dish Corning
Corning Costar cell culture plates 6 well Corning 3506
Refrigerated Bench-Top Microcentrifuge Eppendorf 5415 R
Refrigerated Bench-Top Centrifuge Jouan CR3.12 Jouan 743205604
NanoDrop Lite Spectrophotometer Thermo Scientific ND-LITE-PR
BD FACSCalibur Flow Cytometer BD Bioscience
QuantStudio 3 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific A28567
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beato, M., Sánchez-Aguilera, A., Piris, M. A. Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas. Blood. 101 (4), 1220-1235 (2003).
  2. Chen, H. Z., Tsai, S. Y., Leone, G. Emerging roles of E2Fs in cancer: an exit from cell cycle control. Nat Rev Cancer. 9 (11), 785-797 (2009).
  3. Cho, R. J., et al. Transcriptional regulation and function during the human cell cycle. Nat Genet. 27 (1), 48-54 (2001).
  4. Peña-Diaz, J., et al. Transcription profiling during the cell cycle shows that a subset of Polycomb-targeted genes is upregulated during DNA replication. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2846-2856 (2013).
  5. Grant, G. D., et al. Identification of cell cycle-regulated genes periodically expressed in U2OS cells and their regulation by FOXM1 and E2F transcription factors. Mol Biol Cell. 24 (23), 3634-3650 (2013).
  6. Minderman, H., et al. In vitro and in vivo irinotecan-induced changes in expression profiles of cell cycle and apoptosis-associated genes in acute myeloid leukemia cells. Mol Cancer Ther. 4 (6), 885-900 (2005).
  7. McKenna, E., Traganos, F., Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. Persistent DNA damage caused by low levels of mitomycin C induces irreversible cell senescence. Cell Cycle. 11 (16), 3132-3140 (2012).
  8. Infante, A., et al. E2F2 represses cell cycle regulators to maintain quiescence. Cell Cycle. 7 (24), 3915-3927 (2008).
  9. Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of cell cycle position in mammalian cells. J Vis Exp. (59), (2012).
  10. Schorl, C., Sedivy, J. M. Analysis of cell cycle phases and progression in cultured mammalian cells. Methods. 41 (2), 143-150 (2007).
  11. Lalande, M. A reversible arrest point in the late G1 phase of the mammalian cell cycle. Exp Cell Res. 186 (2), 332-339 (1990).
  12. Park, S. Y., et al. Mimosine arrests the cell cycle prior to the onset of DNA replication by preventing the binding of human Ctf4/And-1 to chromatin via Hif-1α activation in HeLa cells. Cell Cycle. 11 (4), 761-766 (2012).
  13. Ikegami, S., et al. Aphidicolin prevents mitotic cell division by interfering with the activity of DNA polymerase-alpha. Nature. 275 (5679), 458-460 (1978).
  14. Baranovskiy, A. G., et al. Structural basis for inhibition of DNA replication by aphidicolin. Nucleic Acids Res. 42 (22), 14013-14021 (2014).
  15. Adams, R. L., Lindsay, J. G. Hydroxyurea reversal of inhibition and use as a cell-synchronizing agent. J Biol Chem. 242 (6), 1314-1317 (1967).
  16. Mitxelena, J., Apraiz, A., Vallejo-Rodríguez, J., Malumbres, M., Zubiaga, A. M. E2F7 regulates transcription and maturation of multiple microRNAs to restrain cell proliferation. Nucleic Acids Res. , (2016).
  17. Bootsma, D., Budke, L., Vos, O. Studies on synchronous division of tissue culture cells initiated by excess thymidinE. Exp Cell Res. 33, 301-309 (1964).
  18. Galgano, P. J., Schildkraut, C. L. G1/S Phase Synchronization using Double Thymidine Synchronization. CSH Protoc. (2), (2006).
  19. Edwin Taylor, W. Kinetics of inhibition and the binding of h3-colchicine. J Cell Biol. 25, 145-160 (1965).
  20. Zieve, G. W., Turnbull, D., Mullins, J. M., McIntosh, J. R. Production of large numbers of mitotic mammalian cells by use of the reversible microtubule inhibitor nocodazole. Nocodazole accumulated mitotic cells. Exp Cell Res. 126 (2), 397-405 (1980).
  21. Matsui, Y., Nakayama, Y., Okamoto, M., Fukumoto, Y., Yamaguchi, N. Enrichment of cell populations in metaphase, anaphase, and telophase by synchronization using nocodazole and blebbistatin: a novel method suitable for examining dynamic changes in proteins during mitotic progression. Eur J Cell Biol. 91 (5), 413-419 (2012).
  22. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
  23. Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem Mol Biol Educ. 39 (2), 145-154 (2011).
  24. Abbas, T., Dutta, A. p21 in cancer: intricate networks and multiple activities. Nat Rev Cancer. 9 (6), 400-414 (2009).
  25. Kung, A. L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. Cell line-specific differences in the control of cell cycle progression in the absence of mitosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (24), 9553-9557 (1990).
  26. Borel, F., Lacroix, F. B., Margolis, R. L. Prolonged arrest of mammalian cells at the G1/S boundary results in permanent S phase stasis. J Cell Sci. 115 (Pt. 14, 2829-2838 (2002).
  27. Knehr, M., et al. A critical appraisal of synchronization methods applied to achieve maximal enrichment of HeLa cells in specific cell cycle phases). Exp Cell Res. 217 (2), 546-553 (1995).
  28. Zhu, W., Giangrande, P. H., Nevins, J. R. E2Fs link the control of G1/S and G2/M transcription. EMBO J. 23 (23), 4615-4626 (2004).
  29. Whitcomb, E. A., Dudek, E. J., Liu, Q., Taylor, A. Novel control of S phase of the cell cycle by ubiquitin-conjugating enzyme H7. Mol Biol Cell. 20 (1), 1-9 (2009).
  30. Bruinsma, W., Macurek, L., Freire, R., Lindqvist, A., Medema, R. H. Bora and Aurora-A continue to activate Plk1 in mitosis. J Cell Sci. 127, 801-811 (2014).
  31. Thomas, D. B., Lingwood, C. A. A model of cell cycle control: effects of thymidine on synchronous cell cultures. Cell. 5 (1), 37-42 (1975).
  32. Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol Biol Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
  33. Lim, S., Cdks Kaldis, P. cyclins and CKIs: roles beyond cell cycle regulation. Development. 140 (15), 3079-3093 (2013).
  34. Tapia, C., et al. Two mitosis-specific antibodies, MPM-2 and phospho-histone H3 (Ser28), allow rapid and precise determination of mitotic activity. Am J Surg Pathol. 30 (1), 83-89 (2006).
  35. Andreassen, P. R., Martineau, S. N., Margolis, R. L. Chemical induction of mitotic checkpoint override in mammalian cells results in aneuploidy following a transient tetraploid state. Mutat Res. 372 (2), 181-194 (1996).
  36. Wei, F., Xie, Y., He, L., Tao, L., Tang, D. ERK1 and ERK2 kinases activate hydroxyurea-induced S-phase checkpoint in MCF7 cells by mediating ATR activation. Cell Signal. 23 (1), 259-268 (2011).
  37. Kubota, S., et al. Activation of the prereplication complex is blocked by mimosine through reactive oxygen species-activated ataxia telangiectasia mutated (ATM) protein without DNA damage. J Biol Chem. 289 (9), 5730-5746 (2014).
  38. Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246 (4930), 629-634 (1989).
  39. St-Denis, N. A., Derksen, D. R., Litchfield, D. W. Evidence for regulation of mitotic progression through temporal phosphorylation and dephosphorylation of CK2alpha. Mol Cell Biol. 29 (8), 2068-2081 (2009).
  40. Min, A., et al. RAD51C-deficient cancer cells are highly sensitive to the PARP inhibitor olaparib. Mol Cancer Ther. 12 (6), 865-877 (2013).

Tags

Cell CycleGene ExpressionCell SynchronizationU2OS CellsThymidine BlockNocodazoleMitotic Cell ArrestG2-MRNA ExtractionFACS Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Apraiz, A., Mitxelena, J., Zubiaga, A. Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols. J. Vis. Exp. (124), e55745, doi:10.3791/55745 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image